探究黑白栓齒菌凝集對素色素瘤的抑瘤率
1 Introduction
凝集素是非免疫來源的蛋白質(zhì)或糖蛋白，可與細胞表面碳水化合物特異結合，導致細胞凝集或信號轉(zhuǎn)導。凝集素至少有一個碳水化合物識別域，能與糖蛋白或糖脂的多種類型的碳水化合物部分以非共價方式相互作用。凝集素在多種細胞生理過程中發(fā)揮關鍵作用，包括信號轉(zhuǎn)導、細胞間相互作用和分化等。凝集素廣泛存在于病毒、細菌、真菌、植物細胞和動物細胞中。至今，許多凝集素被用作生物技術工具來表征碳水化合物的結構和功能，繪制與各種生理和病理過程相關的細胞表面聚糖變化圖譜。凝集素理化特性的多樣性（例如分子量、分子結構、亞單位數(shù)、碳水化合物特異性）使其具有很大研究和治療應用潛力。
迄今為止，從許多食用菌中分離出的凝集素具有顯著的抗菌、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性。其中一些凝集素能與免疫細胞表面分子特異性相互作用，觸發(fā)具有抗腫瘤活性的細胞因子的分泌。食用菌凝集素由于其新穎的細胞抑制、非細胞毒性和可逆作用機制，是具有廣闊前景的抗腫瘤物質(zhì)。因此，研究食用菌凝集素很有意義。
近日，中國農(nóng)業(yè)大學園藝學院劉慶洪教授、碩士研究生李元慧等在本文分離純化了黑白栓齒菌凝集素，對黑白栓齒菌凝集素的化學結構進行了表征，分析了其理化性質(zhì)，并就其對小鼠黑色素瘤的抑瘤率及免疫學機質(zhì)進行了評價。
2 Results and discussion
2.1 黑白栓齒菌凝集素的純化
將粗凝集素上CM Sepharose柱，組分C3顯示出血凝活性。C3上苯基FF柱，50 mmol/L HAc-NaAc緩沖液（pH 5.4）洗脫的C3P2具有血凝活性。C3P2過Superdex 75凝膠過濾柱，僅檢測到C3P2S3具有血凝活性。隨著純化的進行，凝集活性組分最終在SDS-PAGE上顯示為一條單帶，分子量為14.4 KDa，血凝活性回收率約為60%，純化倍數(shù)為20，黑白栓齒菌凝集素（PML）對兔紅細胞血凝比活力為13319 U/mg。
2.2 凝集素性質(zhì)表征
PML經(jīng)Superdex 200 凝膠過濾柱層析后，保留體積為15.54 mL，通過蛋白標準曲線計算求得，PML 分子量為28.8 kDa。SDS-PAGE結果顯示，PML在還原條件下分子量為14.4 kDa，說明PML由兩個相同分子量的亞基組成。PML在pH 6-9，溫度20-60℃時活性保持穩(wěn)定。Ca2+, Mg2+, Zn2+, Cu2+可不同程度促進PML的血凝活性。
2.3 PML在小鼠模型中的抗腫瘤活性
不同的PML給藥劑量0.5、1.0、2.0 mg/kg，腫瘤抑制率分別為36.1%、47.8%和35.7%。PML對黑色素瘤抑制為出非劑量依賴效應，1.0 mg/kg PML產(chǎn)生了最佳的腫瘤抑制效果，但其抑制率小于CTX（73.3%）。隨著時間的延長，各處理組中小鼠體重均逐漸增長，PML處理對荷瘤小鼠的體重無顯著影響。
進一步研究了PML對小鼠免疫器官指數(shù)的影響。與空白組相比，模型組胸腺指數(shù)顯著降低，而PML組胸腺指數(shù)顯著升高，CTX組的胸腺指數(shù)低于模型組。與空白組相比，模型組脾臟指數(shù)顯著升高，但PML組和模型組的脾臟指數(shù)沒有顯著差異。CTX組脾臟指數(shù)同樣顯著下降。上述結果表明，PML處理能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤引起的胸腺指數(shù)下降，但對脾臟指數(shù)影響不顯著。
2.4 ACF、ACP和ACFP減輕HF飲食誘導的肝功能生物標志物和組織病理學異常變化
細胞因子IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α均參與控制腫瘤生長。IL-2介導免疫細胞激活并顯示抗黑色素瘤的抗腫瘤活性。IL-10是一種細胞因子合成抑制因子；它抑制IL-2、IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生。干擾素-γ具有細胞毒性，有助于啟動腫瘤細胞凋亡，并增強其他免疫抑制機制。TNF-α是一種可溶性細胞毒性因子，通過抑制CD8+T細胞活性、觸發(fā)黑色素瘤脫分化、促進免疫逃逸和黑色素瘤復發(fā)，作為免疫反應的關鍵負性調(diào)節(jié)劑。這些細胞因子在控制黑色素瘤生長方面表現(xiàn)出相互作用和協(xié)同作用。I、II和III組的IL-2含量低于模型組。I、II和III組的IL-10含量高于模型組。所有實驗組的IFN-γ含量均較低。I、II和III組的TNF-α含量低于模型組。IL-2、IL-10、IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生在模型組和CTX組之間沒有顯著差異。
3 Conclusion
通過一系列優(yōu)化的色譜步驟從黑白栓齒菌子實體中純化了一種新的28.8 kDa凝集素，命名為為PML。PML血凝活性不受各種測試糖的抑制，在各種溫度和pH條件下穩(wěn)定。在B16黑色素瘤小鼠模型中，PML顯示出抗腫瘤活性，并增強了細胞因子IL-10的含量。因此，PML是一種很有前途的新型抗癌治療劑。
