分析黃酒糟制香糟自然發(fā)酵過程中微生物群落多樣性
黃酒糟是黃酒生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，是黃酒成熟醪壓榨后留下的固形物。以黃酒糟等為主要原料，經(jīng)壓碎、過篩并與香辛料均勻混合后入壇密封，發(fā)酵后制成香糟。香糟鹵是以香糟為主要原料，通過添加天然植物香辛料、食鹽、黃酒等調(diào)味成分，經(jīng)配制、過濾、滅菌、灌裝等工藝開發(fā)而成的液態(tài)調(diào)味品。目前，優(yōu)質(zhì)香糟鹵的生產(chǎn)常以封壇固態(tài)發(fā)酵3 a形成的香糟為原料，1、2、3 a產(chǎn)品風(fēng)味存在一定差異，發(fā)酵食品風(fēng)味的形成與發(fā)酵過程中的微生物及其代謝產(chǎn)物密切相關(guān)，且黃酒糟發(fā)酵是在相對不受控制和自發(fā)的方式下進行，導(dǎo)致香糟鹵制品風(fēng)味不穩(wěn)定。
高通量測序技術(shù)代替了傳統(tǒng)純培養(yǎng)、聚合酶鏈式反應(yīng)-時間溫度梯度凝膠電泳和聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳等方法，可一次性對樣品中的幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，快速確定其中微生物的種類和豐度，并廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品的微生物群落的宏基因組研究中。
上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院和中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所以發(fā)酵1、2、3 a黃酒糟為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)分析不同發(fā)酵階段黃酒糟樣品微生物組成，客觀地評價微生物種類、數(shù)量及優(yōu)勢菌群的變化規(guī)律，旨在為篩選功能發(fā)酵菌株和發(fā)酵條件優(yōu)化等提供參考。
1 α多樣性分析
α多樣性反映了單個樣品內(nèi)部物種的多樣性，根據(jù)100%相似性水平下的ASV信息，采用α多樣性指標的覆蓋率、擴增序列變體（ASV）數(shù)量、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)對樣品微生物物種的豐富度和多樣性進行評估。
3 個發(fā)酵階段樣品的覆蓋率均在99.95%以上，表明測序數(shù)據(jù)能夠覆蓋樣品中細菌及真菌的種類，真實反映樣品中物種豐度及多樣性；稀釋曲線平緩，說明測序深度較好，測序數(shù)據(jù)量合理。結(jié)果顯示，無論細菌還是真菌，發(fā)酵初期ASV數(shù)量和Chao1指數(shù)均最低，即物種豐度最低。發(fā)酵初期組內(nèi)樣品細菌Chao1指數(shù)差異大，變化范圍為613.91～1017.90，均值為882，發(fā)酵中期和后期Chao1指數(shù)均值為1213和1201，物種豐度呈現(xiàn)向上升后穩(wěn)定的趨勢，發(fā)酵中后期Chao1指數(shù)的浮動趨勢不大，表明樣品中的微生物在逐漸適應(yīng)生長環(huán)境，物種豐度趨于平穩(wěn)。發(fā)酵過程中，細菌Shannon指數(shù)分別為6.39、6.14和6.55，Simpson指數(shù)變化范圍為0.93～0.95；真菌的Shannon指數(shù)分別為6.71、6.88和6.62，Simpson指數(shù)變化范圍為0.97～0.99，多樣性指數(shù)無明顯變化，表明黃酒糟固態(tài)自然發(fā)酵過程微生物群落結(jié)構(gòu)較穩(wěn)定，群落復(fù)雜度不變。
2 微生物物種組成分析
2.1 基于門水平的發(fā)酵黃酒糟菌群結(jié)構(gòu)分析
根據(jù)得到的每個ASV在門分類水平的物種分類信息，分析樣本ASV在門分類水平上的群落結(jié)果。3 組發(fā)酵黃酒糟樣品中細菌及真菌微生物群落組成相似，但相對豐度存在差異。在門水平下，發(fā)酵黃酒糟樣品一共鑒定出31 個細菌物種，結(jié)果顯示豐度水平前10的物種。發(fā)酵黃酒糟中細菌優(yōu)勢菌門分別為變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和放線菌門（Actinobacteria）。變形菌門是黃酒糟發(fā)酵整個過程中的絕對優(yōu)勢菌門，發(fā)酵第1年其平均相對豐度為71.26%，整個發(fā)酵過程，其相對豐度變化不大，發(fā)酵第2年相對豐度上升至75.27%，于發(fā)酵第3年下降至73.22%。這可能是由于變形菌門的一部分細菌為好氧型，不能適應(yīng)黃酒糟發(fā)酵過程中缺氧、產(chǎn)酸、產(chǎn)醇的環(huán)境，因而在發(fā)酵第3年豐度降低。厚壁菌門在發(fā)酵第1年時占較高比例（16.09%），隨發(fā)酵進行其相對豐度逐漸降低并趨于穩(wěn)定。擬桿菌門在黃酒糟發(fā)酵過程中呈現(xiàn)小幅度先上升后下降的趨勢，在黃酒糟發(fā)酵第2年相對豐度達到最高（6.82%）。放線菌門在黃酒糟發(fā)酵過程中呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢，在發(fā)酵第3年相對豐度達到最高（5.78%）。
在門水平下，發(fā)酵黃酒糟樣品共鑒定出10 個真菌物種。發(fā)酵黃酒糟中主要真菌優(yōu)勢菌門分別為子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、被孢霉門（Mortierellomycota）和蛙糞霉門（Basidiobolomycota）。子囊菌門是黃酒糟發(fā)酵整個過程中的絕對優(yōu)勢菌門，發(fā)酵過程中，其相對豐度分別為63.46%、58.07%、51.68%，呈現(xiàn)逐年下降的趨勢。擔(dān)子菌門在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在發(fā)酵第2年其相對豐度達到最高（16.23%）。被孢霉門在發(fā)酵第1、2年相對豐度較接近，呈現(xiàn)輕微下降趨勢，在發(fā)酵第3年相對豐度下降至3.10%。蛙糞霉門在黃酒糟發(fā)酵第1、2年相對豐度接近，分別為1.47%、1.56%，在發(fā)酵第3年其相對豐度下降至0.35%。有研究表明，子囊菌門、擔(dān)子菌門等是多種發(fā)酵食品中的主要真菌種群。
2.2 基于屬水平的發(fā)酵黃酒糟菌群結(jié)構(gòu)與熱圖分析
根據(jù)得到的每個ASV在屬分類水平的物種分類信息，分析樣本ASV在屬分類水平上的群落結(jié)果。在屬水平下，發(fā)酵黃酒糟樣品共鑒定出944 個細菌物種，315 個真菌物種。3 組發(fā)酵黃酒糟樣品中細菌及真菌微生物群落組成相似，但相對豐度存在差異。黃酒糟發(fā)酵過程中排前10的細菌屬分別為水小桿菌屬（Aquabacterium）、短波單胞菌屬（Brevundimonas）、柄桿菌屬（Caulobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、嗜糖假單胞菌屬（Pelomonas）、不黏桿菌屬（Asticcacaulis）、Muribaculaceae、Inhella、毛螺菌科NK4A136組（Lachnospriaceae_NK4A136_group）、芽孢桿菌屬（Bacillus）。發(fā)酵初期，以水小桿菌屬為優(yōu)勢細菌屬，在發(fā)酵過程中由22.48%升高到24.94%，發(fā)酵結(jié)束時恢復(fù)到21.29%，仍為優(yōu)勢屬。
水小桿菌屬于DJ2-3與DJ3-2相對豐度最高，分別為26.52%與25.93%，水小桿菌發(fā)酵可產(chǎn)生聚β-羥基丁酸酯，積聚在細菌體內(nèi)，作為碳源和能源的儲備物質(zhì)。短波單胞菌屬隨著發(fā)酵時間延長相對豐度呈現(xiàn)逐年下降的趨勢；由圖3B可知，與其他發(fā)酵階段相比，慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium）和芽孢桿菌屬在發(fā)酵末期相對豐度較高，如DJ3-1與DJ3-3樣品中慢生根瘤菌屬相對豐度為1.15%與0.95%；芽孢桿菌相對豐度為2.33%與2.35%。芽孢桿菌能影響白酒的風(fēng)味物質(zhì)如酯、醇的形成；同時，乳桿菌屬在發(fā)酵中期相對豐度最高，在DJ2-2與DJ2-3樣品中相對豐度分別為1.60%與1.89%，在發(fā)酵第3年其相對豐度降低至0.64%，乳桿菌屬與乳酸乙酯的形成具有密切關(guān)系，其對于有機酸具有一定的耐受能力，能減弱酵母菌的好氧代謝速度，延長前發(fā)酵期，有利于發(fā)酵有益菌的生長，對香味物質(zhì)增加有利。
由實驗可知，黃酒糟發(fā)酵過程中排前10的真菌屬分別為畢赤酵母屬（Pichia）、Tausonia、被孢霉屬（Mortierella）、曲霉屬（Aspergillus）、裂殼菌屬（Schizothecium）、尖孢鐮刀菌屬（Fusarium）、亞隔孢殼屬（Didymella）、外瓶霉屬（Exophiala）、Phialemoniopsis、Tetracladium。結(jié)果顯示，畢赤酵母在整個發(fā)酵過程中占絕對優(yōu)勢，其在發(fā)酵末期相對豐度最高，在DJ3-2與DJ3-3樣品中相對豐度分別為18.43%與17.41%。畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源，發(fā)酵過程中，原料的植物細胞壁及細胞間質(zhì)的果膠被水解成甲醇，隨著發(fā)酵過程的積累，發(fā)酵后期畢赤酵母豐度達到最高；畢赤酵母具有高產(chǎn)乙酸乙酯的特性，同時是乙酸異丁酯和乙酸異戊酯的第2大生產(chǎn)者，能促進發(fā)酵過程中揮發(fā)性化合物的產(chǎn)生，增強產(chǎn)品的香氣特征。另外，發(fā)酵中期DJ2-2樣品中Tausonia、亞隔孢殼屬、曲霉屬與球腔菌屬（Mycosphaerella）相對豐度較其他發(fā)酵階段高，分別為9.94%、4.21%、9.38%與2.77%。曲霉屬能夠產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶等，是黃酒糟發(fā)酵中淀粉等大分子物質(zhì)分解的主要動力之一。被孢霉屬與裂殼菌屬在發(fā)酵過程中相對豐度呈現(xiàn)逐年下降的趨勢，在發(fā)酵第3年相對豐度均達到最低值，分別為3.10%、1.55%；發(fā)酵末期DJ3-1樣品中，外瓶霉屬、Knufia和雙足囊菌屬（Dipodascus）相對豐度較高，分別為8.81%、4.17%與2.78%。以上結(jié)果表明，黃酒糟同一批次不同樣品間存在差異，表明了固態(tài)自然發(fā)酵過程的不均一性。
同時，由屬水平的菌群結(jié)構(gòu)可以看出，無論是細菌還是真菌，菌群結(jié)構(gòu)都十分復(fù)雜。發(fā)酵過程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)與微生物的生長和代謝密切相關(guān)。這些微生物催化原料不斷進行一系列復(fù)雜的反應(yīng)，可以分解原料中的淀粉、蛋白質(zhì)，形成糖和氨基酸，從而引發(fā)美拉德反應(yīng)，生成黃酒糟獨特的風(fēng)味前體物質(zhì)；能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)分解為小分子肽，并形成重要的香氣成分，例如醛、醇、酯、酮等，進而形成糟鹵清爽醇厚的風(fēng)格特征。
3 β多樣性分析
通過β多樣性分析黃酒糟制香糟發(fā)酵過程中微生物群落組成的差異性，基于Bray-Curtis距離算法對所有樣品進行非度量多維尺度（NMDS）分析，不同樣品間的差異程度，通過點與點的距離表現(xiàn)在圖中，兩點之間的距離越遠，表明兩個樣品中微生物群落的差異越大。對細菌群落測序結(jié)果進行排序分析，其stress值為 0.092＜0.1，排序結(jié)果良好。發(fā)酵第2年與發(fā)酵第3年樣品均分布在1、4象限，而發(fā)酵第1年樣品獨自分布在第2、3象限，表明發(fā)酵第1年樣品的細菌屬組成與其他樣品具有較大差異，綜合α多樣性和菌群結(jié)構(gòu)分析可知，此種差異主要來源于細菌的相對豐度改變。其stress值為 0.075＜0.1，排序結(jié)果良好。其中發(fā)酵第1年與發(fā)酵第2年樣品均分布在第2、3象限，表明這兩年的樣品間具有一定相似性，且與發(fā)酵第3年樣品距離較遠，可能是由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酸類及醇類等物質(zhì)的累積，不適于某些真菌的生長繁殖，導(dǎo)致發(fā)酵第3年與發(fā)酵前兩年的真菌群落結(jié)構(gòu)具有明顯差異。
4 結(jié) 論
本文采用高通量測序分析黃酒糟固態(tài)自然發(fā)酵階段細菌及真菌群落變化情況，黃酒糟微生物群落的多樣性指數(shù)、分類學(xué)組成的變化和聚類分析等表明，黃酒糟發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣。其中，水小桿菌屬、短波單胞菌屬、柄桿菌屬為優(yōu)勢細菌屬，這些菌屬在其他酒糟中的相關(guān)報道較少，這表明微生物結(jié)構(gòu)與發(fā)酵原料、發(fā)酵工藝、地理位置和發(fā)酵環(huán)境有很大的關(guān)系。其中芽孢桿菌屬與乳桿菌屬相對豐度位居前13 位，但對整個發(fā)酵過程起著不可忽視的作用。畢赤酵母、Tausonia、被孢霉屬和曲霉屬為優(yōu)勢真菌屬。綜上，黃酒糟發(fā)酵不同階段的微生物群落存在差異，且發(fā)酵過程對微生物相對豐度具有明顯影響，為進一步研究黃酒糟的發(fā)酵代謝機理及菌株篩選奠定了基礎(chǔ)。
