氨基酸營養缺陷型突變株的篩選

一、目的要求
了解營養缺陷型突變 株選育的原理。
學習并掌握細菌 氨基酸營養缺陷型的誘變、篩選與鑒定方法。

二、基本原理
營養缺陷型是指野生型菌株由于某些物理因素或化學因素處理，使編碼合成代謝途徑中某些酶的基因突變 ，喪失了合成某些代謝產物(如氨基酸、核酸堿基、維生素)的能力，必須在基本培養基中補充該種營養成分，才能正常生長的一類突變株。這類菌株可以通過降低或消除末端產物濃度，在代謝控制中解除反饋抑制或阻遏，而使代謝途徑中間產物或分支合成途徑中末端產物積累。在氨基酸、核苷酸生產中已廣泛使用營養缺陷型菌株；也可用于遺傳學分析、微生物代謝途徑的研究及細胞和分子水平基因重組研究中作為供體和受體細胞的遺傳標記(如鼠傷寒沙門氏菌組氨酸和生物素缺陷型的突變株TAl535：his-,bio-,ΔuvrB,rfa )。
營養缺陷型篩選一般分四個環節，即誘變劑處理、營養缺陷型濃縮、檢出和鑒定。誘變處理突變頻率較低，只有通過淘汰野生型，才能濃縮營養缺陷型而選出少數突變抹。濃縮營養缺陷型有青霉素法、菌絲過濾法、差別殺菌法和饑餓法四種。檢出營養缺陷型也有逐個測定法、影印培養法、夾層培養法和限量補給法四種。鑒定營養缺陷型一般采用生長譜法。
本實驗選用亞硝基胍(NTG)為誘變劑，在堿性時NTG 能形成重氮甲烷(CH2N)、烷化DNA 而使基因突變：pH 5~ 5.5 時，NTG 形成HNO2，本身也是誘變劑；pH 6.0 時，NTG 本身不變化，可作用于核蛋白而引起誘變效應。NTG 是—種超誘變劑，殺菌力較弱，誘變作用較強，其作用部位又往往在 DNA的復制叉處，易造成雙突變。一般選用NTG 處理時，誘變頻率較高，可使百分之幾十的細菌發生營養缺陷型突變，篩選營養缺陷型時，可省去濃縮缺陷型這一環節

三、實驗材料
(一) 菌種
棒桿菌T6-13(谷氨酸產生菌)。
(二) 培養基 配制法見附錄。
1. 細菌完全培養基(簡稱CM)
固體和液體。
2. 細菌基本培養基(簡稱MM)
固體和液體。
3. 無氮基本培養基
在基本培養基中不加(NH4)2SO4(液體)。
4. 2 倍氮源基本培養基
在基本培養基中加入2 倍(NH4)2SO4(液體)
5. 補充培養基(簡稱SM)
為滿足某特定營養缺陷型菌株的營養要求而在基本培養基中加入某—種或幾種營養成分的培養基稱補充培養基。
注：配制基本培養基的藥品均用分析純，使用的器皿應潔凈，需用蒸餾水沖洗2~3 次，必要時用重蒸水沖洗。
瓊脂是從一種海藻中提取的聚半乳糖的的硫酸酯，除含少量的鈣、鎂、鈉、鉀等礦物質外，還含有少量蛋白質、維生素等營養成分，需用洗滌處理過的瓊脂，否則會影響營養缺陷型的篩選結果。洗滌瓊脂的方法有兩種：
(1) 將500 g 瓊脂放于大玻璃缸內，加5 L 蒸餾水和500 mL 氮苯浸泡24 h，然后濾去氮苯液和水，再用蒸餾水洗滌瓊脂三次，用95%的酒精洗滌瓊脂一次，用95%酒精浸泡瓊脂過夜，濾去酒精，再用水洗，最后把洗過的瓊脂在紗布上展成薄層晾干。處理過程約需10 d。
(2) 把瓊脂放在玻璃缸內，用流水洗滌、并浸泡6~7d，用奈氏試劑檢查無銨離子存在時，再用紗布包起來，將水濾干，最后展成薄層晾干備用。