枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法原理

用SPI 培養(yǎng)基和 SPII 培養(yǎng)基結(jié)合EGTA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、試劑配制

1.  SP 鹽
0.2%( NH₄ )₂SO₄，1.4% K₂HPO₄，0.6% KH₂PO₄， 0.02% MgSO_4·7H₂O， 0.1% 檸檬酸鈉。

2.  CAYE (100x)
2% Casamino acid，10%酵母膏。

3.  SPI 培養(yǎng)基
SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100xCAYE 溶液。

4.  SPII 培養(yǎng)基
SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl₂ 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl₂ 溶液。

5.  SP-A Salts Solution(500 ml) 

（1）0.4% (NH₄)₂SO₄ ：2 g
（2）2.8% K₂HPO_4·3H₂O ：14 g
（3）1.2% KH₂PO₄ ：6 g
（4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g
（5）121℃滅菌20 min。

6.  SP-B Salts Solution(500 ml)
（1）0.04% MgSO₄·7H2O： 0.2 g
（2）121℃滅菌20 min。

7.  100xCAYE Solution(100 ml)

（1）2% Casamino acid ：2 g
（2）10% Yeast Extract：10 g 
（3）121℃滅菌20 min。

8.  SPI Medium(20 mL)

 SP-A Salts Solution：9.8 mL
 SP-B Salts Solution：9.8 mL
 (1%V)Glucose(50%w/v，115℃滅菌20 min) ：200 uL
 (1%V)100xCAYE：200 uL

9.  SPII Medium(6 mL)
SPI Medium：5.88mL
(1%V)50mM CaCl₂ ：60uL
(1%V)250mM MgCl₂：60uL

10.  100xEGTA Solution
10mmol/L EGTA 溶液，溶解時(shí)需加少量NaOH 至pH8.0。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1.  準(zhǔn)備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板，37℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。

2.  轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min 培養(yǎng)過夜。

3.  第二天上午取160 ul 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中，37℃，250 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期(168 約4-5 h)。

4.  取0.2 ml 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中，37 ℃，100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘。

5.  在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 ul 10mmol/L EGTA，再于37℃，100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘。

6.  將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 ul DNA(DNA 量不能過高，不超過5 ug)，再于37 ℃，250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。

注意事項(xiàng)

1.  注意儀器用品的干凈和無(wú)菌。

2. 8ml SPI 培養(yǎng)基要放于50 ml 離心管中培養(yǎng)，以保證菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，不要使用玻璃試管。

3. 注意測(cè)定OD值，一定要等菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期。
4. 保證菌體的濃度，可以提高轉(zhuǎn)化率。

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