細(xì)胞膜電位的測定方法
細(xì)胞膜 電位在細(xì)胞通訊中有著重要的作用，本人整理了下利用熒光顯微鏡測定膜電位的方法、用酶標(biāo)儀測定膜電位的方法以及膜電位的標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。
膜電位測定
I. 用熒光顯微鏡 測定膜電位的方法
1. 試劑
·DiBAC4(3)
·Dulbecco’s MEM (DMEM )
·FBS (fetal bovine serum)
2. 方法
1) 將消化好的細(xì)胞移至DMEM中。
2) 加入FBS，控制濃度范圍在：2-15% 。
3) 加入DiBAC4(3)，控制濃度范圍在：1-5 μmol/l。
4) 用熒光顯微鏡觀察刺激后熒光強(qiáng)度的變化。[Ar激光(488 nm) 的激光共聚焦顯微鏡 ]，由于DiBAC4(3)的熒光會隨溫度變化而改變，所以必須在37℃的條件下測定。由于細(xì)胞膜的電位會變化，可以觀察細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的熒光強(qiáng)度變化。
II. 用酶標(biāo)儀測定膜電位的方法
1. 試劑
·DiBAC4(3)
檢測用緩沖液 (pH7.4; 20 mmol/l HEPES, 120 mmol/lNaCl, 2 mmol/l KCl, 2 mmol/l CaCl2, 1 mmol/l MgCl2,
5 mmol/l glucose)
2. 方法
1) 培養(yǎng)細(xì)胞：在微孔板中培養(yǎng)細(xì)胞
2) 清洗細(xì)胞：用含5 μmol/l DiBAC4(3) 的檢測用緩沖液200 μl，清洗微孔板中培養(yǎng)的細(xì)胞2次
3) 染色：在孔板中加入180 μl含5 μmol/l DiBAC4(3) 的檢測用緩沖液，在5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育30
分鐘。
4) 測定：用熒光酶標(biāo)儀觀察刺激后熒光強(qiáng)度的變化。由于DiBAC4(3)的熒光會隨溫度變化而改變，所以必
須在37℃的條件下測定，加入20 μl 含DiBAC4(3) 的檢測用緩沖液，每隔30秒測定1次熒光變化。
III. 膜電位的標(biāo)準(zhǔn)曲線
1. 原理
膜電位變化時色素的分布也隨之變化，所以熒光和吸收也會變化。這種變化程度取決于色素的分子數(shù)和細(xì)胞數(shù)的比率、色素的濃度以及細(xì)胞的種類。膜電位的標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過用電極直接測定目的細(xì)胞的膜電位，在該電位所測得的熒光和吸收強(qiáng)度而制得的。
2. 試劑
·DiBAC4(3)
·Eagle-Dulbecco medium
·PBS
3. 方法
1) 用Eagle-Dulbecco medium培養(yǎng)細(xì)胞。
2) 取PBS中的細(xì)胞在37℃的CO2培養(yǎng)箱中孵育30-60分鐘，然后改變孵育時間，制備不一樣的CO2濃度的樣品。
3) 加入DiBAC4(3)，終濃度為2 μmol/l。
4) 20分鐘后，在517 nm測定各個濃度的熒光強(qiáng)度，并用電極直接測定此時的電位差。
5) 用熒光強(qiáng)度和對應(yīng)的電位差來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
4. 其他方法
有鉀擴(kuò)散電位和熒光或吸收強(qiáng)度比較的方法。纈氨霉素引起鉀擴(kuò)散電位，鉀擴(kuò)散電位 (V) 是按照Nernst 方程計算如下：
V= -RT/F log[K+]in/[K+]out = -59 log[K+]in/[K+]out (mV)
所以在纈氨霉素存在時，通過改變細(xì)胞外鉀離子濃度和細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度，計算擴(kuò)散電位，測定各個電位的熒光或吸收強(qiáng)度，比較后可以得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
細(xì)胞膜電位和細(xì)胞凋亡有著密不可分的關(guān)系，如果細(xì)胞膜電位崩潰就會出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。目前研究最多的是線粒體和細(xì)胞凋亡的關(guān)系，研究線粒體膜電位可以利用熒光顯微鏡，也可以利用流式細(xì)胞儀。
