巨噬細(xì)胞的分離和純化

巨噬細(xì)胞的分離

1 ）從小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分離巨噬細(xì)胞

1． 取 6 周左右的小鼠（或 600 克左右的豚鼠，或 3 公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射 1ml （豚鼠 20ml ，家兔 200ml ）無菌的液體石蠟或巰基乙酸肉湯或 4 ％淀粉肉湯。 3 ～ 4 天以后收集腹腔細(xì)胞。

2． 如要收集腹腔靜置巨噬細(xì)胞，不注射刺激物，直接從這一步開始。放血處死動物，以減少腹腔中的紅細(xì)胞。消毒腹部，沿腹中線注入 3 ～ 4ml （豚鼠 20 ～ 40ml ，家兔 50 ～ 70ml ）冰中預(yù)冷的無菌 PBS-H （含 10U/ml 肝素和 10 ％小牛血清的 PBS ）。輕輕按摩腹部 5 分鐘。

3． 以下均無菌操作。剪開腹壁，用吸管吸出滲出液，再用同樣容量的預(yù)冷 PBS-H 沖洗腹腔 2 ～ 3 次。合并滲出液于離心管中， 4 ℃離心 250 × g 10 分鐘，去上清液。

4． 用預(yù)冷的 RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞 3 次，每次 4 ℃離心 250 × g 10 分鐘，去上清液。用預(yù)冷的適量 RPMI-1640 培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計數(shù)細(xì)胞并決定細(xì)胞活力。

2 ）家兔肺泡巨噬細(xì)胞的分離和純化

1． 取 2 ～ 3 公斤重的家兔，耳緣靜脈注射 10ml 空氣處死動物或注射 2ml （含 130mg ）戊巴比妥麻醉動物。仰臥固定，消毒胸部，剪開胸壁。以下過程注意無菌操作。小心從環(huán)狀軟骨下方剪下氣管，分離心臟和血管，取出肺，剪去脂肪和結(jié)締組織。用無菌紗布小心擦凈肺表面，稱重。

2． 分離肺泡巨噬細(xì)胞：用夾子夾住氣管，使肺懸空。向氣管中注射 40ml 無菌的冷生理鹽水，讓生理鹽水進(jìn)入全部肺泡。用鑷子提起氣管，從夾子下面剪斷氣管，將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法，用 40ml 無菌冷生理鹽水沖洗肺泡，合并浸出液，置 4 ℃。

3． 分離肺組織中的巨噬細(xì)胞：取出肺泡巨噬細(xì)胞后，剪去氣管，將肺組織放在有冷 RPMI-1640 培養(yǎng)液的平皿中。平皿置冰上，用吸滿冷 RPMI-1640 培養(yǎng)液的 20ml 注射器接 23 號針頭，一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織，直到肺組織與支氣管樹全部分離。使肺組織通過 200 目的鋼絲網(wǎng)，分離單個細(xì)胞。

4． 以下過程均在 4 ℃中進(jìn)行。分別處理肺泡巨噬細(xì)胞和肺組織中的巨噬細(xì)胞：離心 200 × g 10 分鐘，去上清液。輕彈試管，懸浮細(xì)胞，加入 10ml 低滲液（ 20mmol/L Tris, 0.75% 氯化銨， pH7.4 ）， 37 ℃處理 3 ～ 5 分鐘，溶解紅細(xì)胞。紅細(xì)胞通常分別占肺泡巨噬細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞的 1 ％和 10 ％。也可以不用低滲處理，直接在淋巴細(xì)胞分離液上分離巨噬細(xì)胞。

5． 離心 200 × g 10 分鐘，去上清液。用 RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次。將細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液（比重 1.077 ）上，離心 400 × g 20 分鐘，收集交界面的巨噬細(xì)胞。棄去沉淀的死細(xì)胞和紅細(xì)胞。

6． 用 RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌巨噬細(xì)胞 2 次。臺盼藍(lán)染色檢測細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù)，將細(xì)胞配成所需濃度。此時巨噬細(xì)胞活力可達(dá) 90 ％以上，巨噬細(xì)胞占全部細(xì)胞的 90 ％以上。

3 ）從小鼠脾臟、胸腺和骨髓中分離巨噬細(xì)胞

1． 用外科方法無菌摘取小鼠脾臟和胸腺，置于盛有預(yù)冷 RPMI-1640 培養(yǎng)液（含 1 ％小牛血清）的平皿中，剪去結(jié)締組織和脂肪。用無菌注射器芯將脾臟或胸腺擠壓通過 200 目的鋼絲網(wǎng)，獲得單個細(xì)胞。

2． 離心 200 × g 10 分鐘，去上清液。用含 1 ％小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液將細(xì)胞配成約 1 × 10⁸ ～ 5 × 10⁸ /ml 。

巨噬細(xì)胞的純化

1 ）用帖壁法純化巨噬細(xì)胞

1． 用含 20 ％～ 40 ％小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液將巨噬細(xì)胞配成 2 × 10⁶ ～ 4 × 10⁶ /ml 的濃度。以每平方厘米 2 × 10⁵ ～ 4 × 10⁵ 個巨噬細(xì)胞的密度將細(xì)胞懸液接種到玻璃培養(yǎng)皿（瓶）或塑料培養(yǎng)皿（瓶）中。 37 ℃ 5 ％ CO₂ 的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 1 小時或 24 小時。 1 小時培養(yǎng)節(jié)省時間但會丟失一些粘附力弱的巨噬細(xì)胞，而 24 小時可以得到較多的巨噬細(xì)胞。 20 ％～ 40 ％的小牛血清可以減少 B 淋巴細(xì)胞的粘附。

2． 搖晃培養(yǎng)皿（瓶），懸浮未粘附細(xì)胞，吸出細(xì)胞懸液。用預(yù)溫的 Hanks 液洗滌細(xì)胞 3 ～ 4 次。懸浮細(xì)胞可重復(fù)粘附，得到更多巨噬細(xì)胞。用適量含 2.5mmol/L EDTA 的無鈣鎂 Hanks 液消化細(xì)胞 37 ℃ 15 ～ 30 分鐘。用吸管吹打分離細(xì)胞，離心 250 × g 10 分鐘，去上清液。

3． 用預(yù)冷的 Hanks 液洗滌細(xì)胞 3 ～ 4 次，每次離心 250 × g 10 分鐘，去上清液。最后用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺盼藍(lán)染色計數(shù)細(xì)胞并決定細(xì)胞活力，將細(xì)胞配成所需的濃度。

2 ）用不連續(xù)密度梯度離心純化巨噬細(xì)胞

1．    取 15ml 離心管，將制備好的各濃度密度梯度材料按下濃上淡的順序依次分層加在離心管中，每個濃度 2ml 。最后加上上述巨噬細(xì)胞懸液 3 ～ 5ml （約含 2 × 10⁷ ～ 5 × 10⁷ 細(xì)胞）。

2．    4 ℃中，水平離心 1000 × g 30 分鐘，垂直取出離心管，小心吸出各交界面的細(xì)胞。分別用預(yù)冷的含 1 ％小牛血清 RPMI-1640 培養(yǎng)液洗滌各交界面細(xì)胞 2 次，每次 200 × g 10 分鐘。用含 10 ％小牛血清的 RPMI-1640 培養(yǎng)液將細(xì)胞配成所需的濃度。