干細胞的凍存方法與細胞計數
一般干細胞 的凍存方法
1、材料：
生長良好之培養細胞、新鮮培養基、DMSO (Sigma D-2650)、無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球計數盤與蓋玻片、等速降溫機(KRYO10SeriesII)。
2、冷凍保存方法：
(1)傳統方法：冷存管置于4℃10分鐘→ -20℃30分鐘→ -80℃16～18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
(2)程序降溫：利用已設定程序的等速降溫機以-1～-3℃/分鐘之速度由室溫降至(-80℃以下)-120℃，再放在液氮槽vaporphase長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma之保存。
3、步驟：
(1)冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。
(2)配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO加入新鮮培養基中，最后濃度為5～10%，混合均勻，置于室溫下待用。
(3)依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1ml)計數細胞濃度及凍前存活率。
(4)離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1～5×106Cell s/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。
4、注意事項：
(1)欲冷凍保存之細胞應在生長良好(logphase)且存活率高之狀態，約為80–90%致密度。
(2)冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma應在冷凍保存前一至二日測試是否有抗體之產生。
(3)注意冷凍保護劑之品質。DMSO應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22micron FGLP Telflon過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650)，以5～10ml小體積分裝，4℃避光保存，勿作多次解凍。Glycerol亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。
(4)冷凍保存之細胞濃度：
①normal human fibroblast:1～3×106cells/ml
②hybridoma：1～3×106cells/ml，細胞濃度不要太高，某些hybridoma會因冷凍濃度太高而在解凍24小時后死去。
③adherent tumor lines：5～7×106，依細胞種類而異。Adenocarcinoma解凍后須較高之濃度，而HeLa只需1～3×106cells/ml
④other suspensions：5～10×106cells/ml，human lymphocyte須至少5×106cells/ml。
(5)冷凍保護劑濃度為5或10%DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
二、冷凍細胞活化
1、冷凍細胞之活化原則為快速解凍，以避免冰晶重新結晶而對細胞造成傷害，導致細胞之死亡。
2、細胞活化后，約需數日，或繼代一至二代，其細胞生長或特性表現才會恢復正常(例如產生單株抗體或是其它蛋白質)。
3、材料 ：37℃恒溫水槽、新鮮培養基、無菌吸管/離心管/培養瓶、液氮或干冰容器 。
4、步驟：
(1)操作人員應戴防護面罩及手套，防止冷凍管可能爆裂之傷害。
(2)自液氮或干冰容器中取出冷凍管，檢查蓋子是否旋緊，由于熱脹冷縮過程，此時蓋子易松掉。
(3)將新鮮培養基置于37℃水槽中回溫，回溫后噴以70%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。
(4)取出冷凍管，立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1分鐘內全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入無菌操作臺內。
(5)取出解凍之細胞懸浮液，緩緩加入有培養基之培養容器內(稀釋比例為1：10～1：15)，混合均勻，放入CO2培養箱培養。取0.1ml解凍細胞懸浮液作存活測試。
(6)解凍后是否立即去除冷凍保護劑(例如DMSO或glycerol)，依細胞種類而異，一般而言，大都不需要立即去除冷凍保護劑。惟若要立即去除，則將解凍之細胞懸浮液加入含有5-10ml培養基之離心管內，離心1000rpm，5分鐘，移去上清液，加入新鮮培養基，混合均勻，放入CO2培養箱培養。
(7)若不需立即去除冷凍保存劑，則在解凍培養后隔日更換培養基。
三、細胞計數與存活測試
1、原理：
(1)計算細胞數目可用血球計數盤或是Coultercounter粒子計數器自動計數。
(2)血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber中細刻9個1mm2大正方形，其中4個角落之正方形再細刻16個小格，深度均為0.1mm。當chamber上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml中之細胞數目。
(3)存活測試之步驟為dyeexclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish。
2、材料：
0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL15250-061);Erythosin bluish stain;取0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259)及0.05gram preservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于100mlCa++/Mg++freesaline;血球計數盤及蓋玻片(Hemocytometerandcoverslip);計數器(counter);低倍倒立顯微鏡;粒子計數器(Coultercounter,CoulterElectronics)。
3、步驟：
(1)取50μl細胞懸浮液與50μl trypan blue(orErythrosinbluish)等體積混合均勻于1.5ml小離心管中。
(2)取少許混合液(約15μl)自血球計數盤chamber上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色(或紅色-Erythrosin bluish)。
(3)計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數(至少乘以2，因與trypanblue等體積混合)，最后乘以104，即為每ml中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
注：4大格細胞總數×稀釋倍數×104/4=細胞數/ml;每一大格的體積=0.1cm×0.1cm×0.01cm=10-4ml
4、范例：
T75 monolayer culture制成10ml細胞懸浮液，取0.1ml溶液與0.1ml trypan blue混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內之細胞數目。
活細胞數/方格：55，62，49，59;死細胞數/方格：5，3，4，6;細胞總數=243
平均細胞數/方格=60.75;稀釋倍數=2
細胞數/ml：60.75×104×2(稀釋倍數)=1.22×106
細胞數/flask(10ml)：1.22×106×10ml=12.2×106
