神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的注意事項(xiàng)大總結(jié)
本期的主題的神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)，大家可以踴躍分享下自己的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)，細(xì)胞培養(yǎng) 基無外是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，添加一些細(xì)胞培養(yǎng)添加劑，當(dāng)然血清、抗生素等也是細(xì)胞培養(yǎng)中重要組成部分。
培養(yǎng)細(xì)胞的完全培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基(如MEM)和添加劑(如血清或無血清培養(yǎng)用的某些確定的激素及生長因子)組成，培養(yǎng)基的配方一直在改進(jìn)，其中包括抗生素和抗有絲分裂劑等等。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基
絕大多數(shù)培養(yǎng)基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎(chǔ)上，添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營養(yǎng)物質(zhì)。最廣泛應(yīng)用的培養(yǎng)基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸，維生素的范圍亦很廣，另外常規(guī)含有無機(jī)鹽和代謝添加劑(例如核苷酸)。MEM/F12 這兩種培養(yǎng)基各取1/2，形成神經(jīng)生物學(xué)最通用的培養(yǎng)基。Dulbecco`s改良培養(yǎng)基――DMEM ，現(xiàn)應(yīng)用于快速生長的細(xì)胞，同MEM含有相同的營養(yǎng)成分，但濃度高出2~4倍。選擇某種培養(yǎng)基，應(yīng)仔細(xì)了解成分表，應(yīng)知道大多數(shù)情形下培養(yǎng)基都有不足。例如，有些培養(yǎng)基在氨基酸中包括有谷氨酸，而這種培養(yǎng)基雖廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域，但它對(duì)某些對(duì)谷氨酸敏感的可能有細(xì)胞外毒性損傷的神經(jīng)元而言，則并非最佳選擇，特別是如果神經(jīng)元生長在缺乏膠質(zhì)的環(huán)境中時(shí)。 F12中含有硫酸亞鐵，據(jù)報(bào)道也有神經(jīng)毒效應(yīng)。
在所有這些培養(yǎng)基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的濃度，這是因?yàn)樗哂胁环€(wěn)定性以及在許多細(xì)胞培養(yǎng) 中它常用作碳源。對(duì)于神經(jīng)元的培養(yǎng)常常在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培養(yǎng)基中這兩種物質(zhì)缺乏時(shí))。MEM與F12均要用5% 的CO2來平衡，DMEM含更高濃度的NaCO3，要用10%的CO2來平衡，當(dāng)然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎(chǔ)培養(yǎng)基的組成成分是建立在對(duì)不同細(xì)胞系生長的研究之上的，但通常在原代培養(yǎng)中使用也能有比較令人滿意的結(jié)果。
原則上，HEPES作為緩沖劑可用來代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養(yǎng)環(huán)境的限制。實(shí)際操作中并非如此簡單。顯然，溶解的CO2與碳酸氫鹽對(duì)良好的細(xì)胞生長是重要的。Leiboviz`s L15培養(yǎng)基可用來在大氣環(huán)境中令神經(jīng)細(xì)胞生長，該培養(yǎng)基采用了與眾不同的BSS作基礎(chǔ)，它含有高濃度的氨基酸來提高緩沖能力，培養(yǎng)基中使用半乳糖作碳源，以阻止培養(yǎng)基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產(chǎn)生。這一培養(yǎng)基的優(yōu)點(diǎn)是明顯的，特別是在保持較高CO2有困難時(shí)，例如在長時(shí)間的顯微操作及生理學(xué) 研究中。L15培養(yǎng)基已用來成功的培養(yǎng)了外周神經(jīng)元，但尚未在CNS神經(jīng)元的發(fā)育研究中全面檢測(cè)過。
血清
細(xì)胞在單純的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中不能存活，在特殊類型的細(xì)胞培養(yǎng) 中必須提供某些痕量營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子才能使細(xì)胞得以生長并維持生長狀態(tài)。基礎(chǔ)培養(yǎng)基常常要添加血清，血清終濃度多為5~20%。特殊用途的血清來源須用經(jīng)驗(yàn)確定，廣泛應(yīng)用的血清種類有馬血清與胎牛血清。胎牛血清中富含有絲分裂因子，常選其作增殖細(xì)胞用的血清，也用于細(xì)胞系和原代培養(yǎng)。而馬血清常常用來作有絲分裂后的神經(jīng)元培養(yǎng)。然而，很多人也將胎牛血清用于神經(jīng)元培養(yǎng)，也有人用馬血清來培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞。用大鼠進(jìn)行神經(jīng)元培養(yǎng)的某些研究者喜歡使用同型血清;人類的胎盤血清，亦曾用于神經(jīng)組織的器官類型的培養(yǎng)，也用在一些特殊培養(yǎng)種類中。
血清的不同批號(hào)含有不同的成分，所以許多人發(fā)現(xiàn)，應(yīng)該在使用前對(duì)血清進(jìn)行測(cè)試。大多數(shù)試劑商提供樣品，所滿意的批號(hào)即可選用，這樣可以一次得到足夠一年用量的血清，血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘，這一過程稱為滅活。
無血清培養(yǎng)基
1979年神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)了一個(gè)重要進(jìn)展，用化學(xué)添加劑即可維持神經(jīng)細(xì)胞存活與生長而不需要在培養(yǎng)基中添加血清。其工作基礎(chǔ)是用合適的激素、營養(yǎng)物和促貼壁的物質(zhì)的組合置換培養(yǎng)基中的成分，最后找到了適合大多數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)的試劑配方，該配方稱為N2，專門用于神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，最早是用在B104大鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系的培養(yǎng)。它的基礎(chǔ)培養(yǎng)基是1：1的DMEM與H12的混合液，添加了胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、黃體酮、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長因子對(duì)于大多數(shù)類型細(xì)胞的存活和生長有重要作用，硒是谷胱甘肽產(chǎn)生的合作因子，可能有助于過氧化物和超氧化物的水解，有報(bào)道說還能防止細(xì)胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉(zhuǎn)鐵蛋白。
未料到的是上述配方構(gòu)成的培養(yǎng)基可以支持神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系快速增殖，隨后又發(fā)展了能支持原代培養(yǎng)的各種神經(jīng)元生長的培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基在許多實(shí)驗(yàn)室里已取代了有血清培養(yǎng)。在某些培養(yǎng)方案中，細(xì)胞直接進(jìn)入無血清培養(yǎng)，這樣的培養(yǎng)基可以消除來自血清的不均一性。更為重要的是，它們可用來檢測(cè)生長因子以及其他促進(jìn)神經(jīng)元存活或生長的因子，或者用來檢測(cè)那些可保護(hù)神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑。專用于神經(jīng)元的培養(yǎng)基在某些培養(yǎng)環(huán)境中還可以減低非神經(jīng)元細(xì)胞的增殖，故可使神經(jīng)元純化。
血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養(yǎng)基中。當(dāng)缺乏這些成分時(shí)，如神經(jīng)元在無血清培養(yǎng)基中生長時(shí)，特別容易為過氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了。過氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養(yǎng)基中過氧化物和超氧化物的累積，有報(bào)道講可以促進(jìn)低密度培養(yǎng)細(xì)胞的存活。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活可為氧分壓的下降而促進(jìn)。因而，無血清培養(yǎng)基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如，維生素E和丙酮酸，可作為過氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養(yǎng)時(shí)變小，特別是神經(jīng)元與膠質(zhì)共培養(yǎng)時(shí)，它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質(zhì)如谷氨酸。
應(yīng)該注意，盡管無血清培養(yǎng)基是有化學(xué)限定性的，但在培養(yǎng)過程中它仍有變動(dòng)，培養(yǎng)起始時(shí)可能有些物質(zhì)缺乏，而后細(xì)胞的產(chǎn)物可能積累，從而使培養(yǎng)基的成分改變。這其實(shí)是有另一方面的好處，即條件培養(yǎng)基(已培養(yǎng)過細(xì)胞的培養(yǎng)基)的形成，條件培養(yǎng)基常常用來增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育。
生長因子絕大多數(shù)哺乳類胚胎神經(jīng)元有嚴(yán)格的營養(yǎng)要求，若不能提供適宜的生長因子或合適的因子組分，將會(huì)使絕大多數(shù)神經(jīng)元在體外培養(yǎng)的數(shù)天中死亡。解決這一問題有兩條思路，一是讓培養(yǎng)細(xì)胞提供自己的營養(yǎng)因子，二是在培養(yǎng)基中加入純的生長因子。如果細(xì)胞混合物能在高密度時(shí)生長，所需的生長因子便會(huì)積累到可觀的數(shù)值，尤其當(dāng)培養(yǎng)基很少變化時(shí)。若某種細(xì)胞混合物生長時(shí)有很少的營養(yǎng)需求，可保持培養(yǎng)基在一段時(shí)間里不作任何變動(dòng)，以使?fàn)I養(yǎng)(生長)因子積累，而最后促使所需要的細(xì)胞類型能夠生長。但是，這種對(duì)營養(yǎng)(生長)因子自身倚賴性亦有弊端，因?yàn)橥ǔＴ诨旌霞?xì)胞群體中細(xì)胞很難有同比例增殖，某些細(xì)胞會(huì)因生長條件的貧乏而受限制。另外，這種方法只能進(jìn)行相當(dāng)高密度的細(xì)胞培養(yǎng)。因?yàn)榕囵B(yǎng)基的條件在細(xì)胞的較低密度時(shí)變的不夠有效。不過某些時(shí)候純化神經(jīng)元群體的低密度培養(yǎng)可用條件培養(yǎng)基(經(jīng)過了高密度培養(yǎng))進(jìn)行，或在膠質(zhì)上生長的神經(jīng)元所用過的培養(yǎng)基來支持。滿足神經(jīng)元營養(yǎng)需求的第二條途徑是向培養(yǎng)基中加入生長因子。通常用于組培的通用適宜因子是神經(jīng)生長因子NGF。不過，只有少數(shù)對(duì)這種蛋白質(zhì)有反應(yīng)的細(xì)胞類型的細(xì)胞才能生長。
許多PNS類型的神經(jīng)元在離體狀態(tài)時(shí)表現(xiàn)出簡單的營養(yǎng)需求，只需提供單一的營養(yǎng)因子就足以使其在低密度時(shí)增殖。例如，大鼠交感神經(jīng)元僅需NGF即能存活，在其生存期間，這些神經(jīng)元可在嚴(yán)格局限條件下生長好幾個(gè)月(即在無血清培養(yǎng)基中、或缺乏膠質(zhì)細(xì)胞、或在化學(xué)限定基質(zhì)上)。有證據(jù)表明NGF是活體中交感神經(jīng)元存活的生理調(diào)節(jié)因子。然而，交感神經(jīng)元也對(duì)來自膠質(zhì)細(xì)胞的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)有反應(yīng)，還有NT3、LIF與CNTF也對(duì)其有作用。在不產(chǎn)生 GDNF或NT3的動(dòng)物中，交感神經(jīng)元會(huì)有損傷。在離體與活體營養(yǎng)需求之間的差別或許可以用在不同環(huán)境中NGF含量和分布的不同來解釋，培養(yǎng)中的NGF彌散在整個(gè)環(huán)境中，而在活體內(nèi)，大部分區(qū)域的含量是有限的。因此，NGF的重要性在于其合適的濃度。盡管在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)習(xí)慣了營養(yǎng)因子的最大效應(yīng)使用量，其他營養(yǎng)因子的協(xié)同效應(yīng)在亞優(yōu)劑量下更容易觀察到。此外，高濃度的營養(yǎng)因子可使細(xì)胞更能抵抗毒劑以及其他壓力。相應(yīng)的，低濃度的營養(yǎng)因子可能用來檢查表現(xiàn)型，例如對(duì)自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應(yīng)。有許多其他的PNS培養(yǎng)系統(tǒng)只需單一營養(yǎng)因子就可使有實(shí)用價(jià)值的細(xì)胞保持在一定比例，廣為人知的有雛雞睫狀自主神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和大鼠背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元。不過，這些模型也有局限性。例如，培養(yǎng)中的睫狀神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元加入CNTF時(shí)，超過90%的神經(jīng)元能存活一個(gè)很長時(shí)期，但并未有跡象表明它屬于內(nèi)源的靶細(xì)胞來源的營養(yǎng)因子，而是有爭論的相關(guān)分子，GPA，扮演了這一角色。大鼠背根神經(jīng)節(jié)含有好幾種細(xì)胞群體，其中小細(xì)胞群、包括nocioceptive cell，對(duì)NGF有反應(yīng)，但其他神經(jīng)元，例如大細(xì)胞群中的proprioception 卻對(duì)不同的神經(jīng)營養(yǎng)因子有反應(yīng)。因此，在大多條件下培養(yǎng)物的生長并不能忠實(shí)反映親代群體的所有特性，這一問題在CNS的細(xì)胞培養(yǎng)中特別突出，因?yàn)橐延械慕?jīng)驗(yàn)表明，沒有一種培養(yǎng)基能適合于所有類型及亞類的神經(jīng)細(xì)胞的生長。
現(xiàn)有的證據(jù)已表明，CNS神經(jīng)元的營養(yǎng)需求比PNS的更復(fù)雜。對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞神經(jīng)元的研究表明，這些神經(jīng)元與外周神經(jīng)元相比能對(duì)更為廣泛的營養(yǎng)因子起反應(yīng)。例如，至少發(fā)現(xiàn)了15種不同的分子可在離體條件下增加神經(jīng)元的存活。而且，已觀察到運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與視網(wǎng)膜對(duì)任何單獨(dú)的營養(yǎng)因子的存活反應(yīng)，與PNS中所觀察到的典型反應(yīng)相比，都要小得多。因此，大多數(shù)影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的營養(yǎng)因子僅僅只能支持神經(jīng)元的亞群，而神經(jīng)元的最佳存活要求諸多因子的結(jié)合。在視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的培養(yǎng)中，因子的最佳組合(如BDNF、CNTF、IGF、bFGF)包括了來自不同生長因子家族的代表。這一結(jié)果的普遍性尚待進(jìn)一步的證實(shí)，但敲除單一的營養(yǎng)因子基因之后，沒有表現(xiàn)出對(duì)CNS大多類群的神經(jīng)元的存活產(chǎn)生太大影響，這一觀察與上述的事實(shí)是一致的。現(xiàn)已知少突膠質(zhì)細(xì)胞的長期存活也需要眾多營養(yǎng)因子的相互作用。
抗生素
在細(xì)胞培養(yǎng)中最常用的抗生素是青霉素(常用濃度是25~100ui/ml)與鏈霉素(25~100μg/ml)。這兩種抗生素常混合使用。在一些實(shí)驗(yàn)室里，它們常規(guī)加入所有的培養(yǎng)基中。慶大霉素(10~100μg/ml)通常有廣譜抗菌效應(yīng)，并具有溶液穩(wěn)定性，故也被一些實(shí)驗(yàn)室使用，特別是當(dāng)有低水平的污染存在時(shí)更是這樣。以上這些試劑對(duì)霉菌與酵母菌的污染均無效。
盡管很多實(shí)驗(yàn)室在細(xì)胞系的培養(yǎng)基中常規(guī)加入抗生素作繼代培養(yǎng)，但仍建議不要在原代培養(yǎng)中加入抗生素，其理由之一是獲得的細(xì)胞是無菌的，原代培養(yǎng)時(shí)的細(xì)菌污染很少發(fā)生。其次，盡管認(rèn)為抗生素對(duì)細(xì)胞代謝的影響可忽略，但最好避免使用它們，以免細(xì)胞生長環(huán)境的不穩(wěn)定。最重要的是要意識(shí)到培養(yǎng)中主要污染物的類型，它們通常暗示了問題的來源。
抗有絲分裂劑
某些DNA合成抑制劑對(duì)分裂細(xì)胞有毒，但對(duì)沒有DNA合成的細(xì)胞僅有輕微影響。由于神經(jīng)元通常缺乏DNA合成能力，因此對(duì)抗有絲分裂劑沒有多大反應(yīng)。這樣的試劑常常用于神經(jīng)元的培養(yǎng)，以消除或減少非神經(jīng)元群體。若要?dú)⑺浪械姆巧窠?jīng)元細(xì)胞，可以先加入血清或生長因子來保證有高比例的非神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行DNA合成，此時(shí)再加入抗有絲分裂劑。但是，某些細(xì)胞在它的細(xì)胞周期的某些時(shí)相時(shí)對(duì)抗有絲分裂劑是不敏感的。不過，可以重復(fù)的將抗有絲分裂劑使用于增殖的細(xì)胞群體。在CNS神經(jīng)元的培養(yǎng)中抗有絲分裂劑常常在星形細(xì)胞形成單層后加入，此時(shí)，星形細(xì)胞由于接觸抑制而終止了DNA的合成(即細(xì)胞停止增殖)，它們不會(huì)因抗有絲分裂劑的加入而死亡。原代培養(yǎng)中用這種方法阻止成纖維細(xì)胞的過度增殖是十分必要的。有兩種抗有絲分裂劑常用于神經(jīng)元的培養(yǎng)： Fluorodexyuridine，是胸苷合成酶抑制劑，一般使用濃度為～10μM。尿苷(10μM)也常使用，可阻止不分裂細(xì)胞的RNA合成。另外，阿糖胞苷也常被使用，其使用濃度為5～50μM。使用任何一種抗有絲分裂劑，都必須考慮它的神經(jīng)原毒性，應(yīng)該確定最低效應(yīng)的使用濃度。阿糖胞苷在很低的濃度下，也會(huì)對(duì)某些種類的神經(jīng)元有毒性，可以造成特定神經(jīng)原的死亡。其他的抗有絲分裂劑尚未表現(xiàn)出這種毒性。
培養(yǎng)的保持
培養(yǎng)物是應(yīng)該保持在孵箱中的。孵箱可以自動(dòng)將O2與CO2混合很快達(dá)到培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)要求，空氣中的氧濃度比血液和腦脊液中要高得多。對(duì)于某些細(xì)胞的生長，包括神經(jīng)元，應(yīng)使氧含量處在一個(gè)較低的水平。可以用孵箱達(dá)到這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，但這樣的孵箱并未廣泛使用。
高濕度可避免培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基的蒸發(fā)，保持孵箱中的濕度通常是在箱底部放上一大盆水，這水應(yīng)該經(jīng)常換，乘水容器應(yīng)經(jīng)常消毒以防霉菌生長。若孵箱曾被霉菌孢子嚴(yán)重污染過，那么要想完全去除污染則會(huì)非常困難。當(dāng)培養(yǎng)物必須要長期保持在孵箱中時(shí)，應(yīng)采用較少培養(yǎng)基的瓶、皿，且將蓋子蓋緊以避免蒸發(fā)，或采用相應(yīng)的按比例供空氣的孵箱。
溫度的精確調(diào)節(jié)應(yīng)定期檢查，孵箱溫度常設(shè)置為37℃或較低溫度。細(xì)胞在低溫時(shí)可有較長時(shí)間的忍耐限度，但當(dāng)溫度升至39℃時(shí)，幾小時(shí)內(nèi)即死亡。
維持培養(yǎng)物的最佳方案常常改變。例如培養(yǎng)膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，要經(jīng)常換液以使其增殖達(dá)到最大。而在培養(yǎng)某些神經(jīng)元時(shí)，則要求盡可能少的換液，神經(jīng)元在兩次換液之間的條件下長的最好。大腦皮質(zhì)的培養(yǎng)要求在不換液的情形下維持一個(gè)月以上。另一方面，象海馬神經(jīng)元那樣的細(xì)胞，依賴于條件培養(yǎng)基，若換液太頻繁細(xì)胞就會(huì)衰退，此時(shí)，可采用1/3或1/2換液的方式。
