細胞介導細胞毒作用檢測法3:LDH釋放法
LDH 釋放法
1 )測定方法
1. 用含 5 %小牛血清的 RPMI-1640 培養液將靶細胞調整到 5 × 104 ~ 2 × 105 /ml ,此濃度需根據情況預先標定。
2. 在 96 孔圓底細胞培養板中加入靶細胞,每孔加 100 μ l 。 3 個效應細胞自然釋放對照孔不加靶細胞,只加 100 μ l 培養液。
3. 向各孔加 100 μ l 效應細胞,效應細胞與靶細胞的比例根據要求而定,通常為 5 : 1 ~ 20 : 1 。自然釋放孔不加效應細胞只加 100 μ l 培養液,最大釋放孔中加 100 μ l 1 % NP40 。每個實驗置三個復孔。
4. 置 37 ℃ 5 % CO2 的二氧化碳培養箱中培養 4 ~ 6 小時。
5. 離心培養板 200 × g 10 分鐘。每孔吸出 150 μ l 上清液,對應加入另一塊 96 孔酶聯檢測板中。向第二塊板每孔依次加 20 μ l 0.4mol/L 乳酸溶液、 20 μ l 4mmol/L 2-p- 碘苯酯 -3-p- 氯化硝基苯四唑, 20 μ l 反應液(含 0.03 % BSA , 2.7U/ml 硫辛酰胺脫氫酶, 4.5mmol/L 氫化型輔酶 I ( NAD + ), 1.2 %蔗糖的 PBS ),室溫中放置 20 分鐘。
6. 在酶聯檢測儀上測定各孔的光密度( OD 值),檢測波長 492nm ,參考波長 650nm 。
2 )特異性殺傷活性的計算
殺傷活性(%)= [ ( OD 實驗組- OD 總自然釋放) / ( OD 最大釋放組- OD 總自然釋放) ] × 100 %