植物多倍體誘導(dǎo)及其細(xì)胞學(xué)鑒定

一、目的要求
通過(guò)實(shí)驗(yàn)掌握誘導(dǎo)植物多倍體的方法和技術(shù)，觀察多倍體的特點(diǎn)及染色體 加倍后的細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)。利用染色體分析的方法對(duì)多倍體的細(xì)胞作出準(zhǔn)確判斷。

二、基本原理
生物體的細(xì)胞核 中都有相對(duì)穩(wěn)定的染色體數(shù)目，這是物種的基本特征之一。如玉米的體細(xì)胞具有20 條染色體，人類則具有46 條染色體，但是這些細(xì)胞核內(nèi)的染色體并不是雜亂無(wú)序的，而是組成一個(gè)或多個(gè)染色體組（genome)，或稱基因組。在同一染色體組內(nèi)所有的染色體在形態(tài)上以及染色體上攜帶的基因都不相同，但是它們包含了這一物種最基本的全套遺傳物質(zhì)，并以完整而協(xié)調(diào)的方式發(fā)生作用，構(gòu)成了完整、協(xié)調(diào)的基因體系。在進(jìn)化過(guò)程中由于選擇壓力的影響，這些基因以其平衡、協(xié)調(diào)的方式與環(huán)境相互作用，缺乏染色體組中的任何成分將面臨淘汰的危險(xiǎn)。
每個(gè)染色體組所包含的染色體數(shù)目稱為基數(shù)（basic nμmber) ，通常以X 表示。例如玉米的20條染色體包含了2 個(gè)染色體組，X=10。兩組染色體之間有成對(duì)的同源染色體( homologous chromosome ) ，在減數(shù)分裂過(guò)程中，每對(duì)同源染色體的2 個(gè)成員分到2 個(gè)子細(xì)胞中，因此配子細(xì)胞只含有體細(xì)胞中2 組染色體中的1 組。一倍體（monoploid）是指細(xì)胞核中具有一個(gè)染色體組，而單倍體（haploid）是指其細(xì)胞核內(nèi)所含的染色體數(shù)與該物種配子中所含的染色體數(shù)目一樣。就個(gè)體發(fā)育而言生物體生殖細(xì)胞是單倍的，但是由于產(chǎn)生配子的生物體的倍性水平不同，配子可以是一倍的也可是非一倍的。
多倍體是在細(xì)胞中具有3 個(gè)或3 個(gè)以上的染色體組的生物體。自然界中有許多植物 是多倍體的，是變異發(fā)生的重要途徑之一。多倍體植物在形態(tài)上較二倍體的植物個(gè)體大，葉片上的氣孔也很大，因此很容易辨認(rèn)。多倍體的研究在育種工作中非常重要，因?yàn)槔枚啾扼w可以改良作物的某些經(jīng)濟(jì)性狀，同時(shí)還可利用多倍體克服遠(yuǎn)緣雜交過(guò)程中的障礙。利用一些誘發(fā)因素可以人工誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多倍體。這些因素包括物理的因素，如溫度的劇變、射線處理等，還有化學(xué)因素，如植物堿、植物生長(zhǎng)激素等。在眾多的化學(xué)藥品中，秋水仙素是誘導(dǎo)多倍體形成最為有效和常用的藥品之一。在適宜濃度的秋水仙素的作用下，它既可以有效地阻止紡錘體的形成，又不至于對(duì)細(xì)胞發(fā)生較大的毒害。因此，當(dāng)細(xì)胞繼續(xù)分裂后，可以使細(xì)胞的染色體數(shù)加倍。如果用秋水仙素處理植物的根尖，則在根尖分生區(qū)內(nèi)可檢測(cè)到大量染色體加倍的細(xì)胞，若處理植物幼苗的芽，則可以得到染色體加倍的植株。

三、器材
搪瓷盤(pán)、鑷子、剪刀、燒杯、培養(yǎng)皿、恒溫水浴鍋、紗布、試管、2.0～4.0g/L 秋水仙素水溶液、改良苯酚品紅染液、蠶豆、洋蔥、小麥種子、小麥幼苗、Carnoy 固定液。

四、操作步驟
1．蠶豆材料的處理：在盛有蛭石和沙土的花盆內(nèi)埋入蠶豆種子，在盆內(nèi)澆適量清水。將花盆放在窗臺(tái)上陽(yáng)光充足的地方進(jìn)行萌發(fā)。經(jīng)常進(jìn)行觀察，約4～6d 蠶豆的主根長(zhǎng)到3cm 左右，側(cè)根長(zhǎng)到1～1.5cm 時(shí)，將蠶豆取出。用清水將蠶豆上的泥土沖凈，然后放入盛有4.0g/L 的秋水仙素水溶液的小燒杯內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)3～4d，待觀察到根尖膨大時(shí)取材固定。與在水中培養(yǎng)的蠶豆做對(duì)照，進(jìn)行染色體分析。
2. 洋蔥的處理：將搪瓷盤(pán)的盤(pán)口用線繩編織成許多網(wǎng)格，在盤(pán)內(nèi)注人清水。把洋蔥的鱗莖洗干凈，用刀片將鱗莖上的老根削除，再把其放在搪瓷盤(pán)的網(wǎng)格上，使其生根部位恰好接觸到水面，在25℃下培養(yǎng)幾日。待新根剛剛長(zhǎng)出時(shí)，將搪瓷盤(pán)內(nèi)的清水換成4.0g/L 的秋水仙素水溶液，用繼續(xù)在水中培養(yǎng)的洋蔥鱗莖作對(duì)照。培養(yǎng)幾日后，在處理液中培養(yǎng)的根尖明顯比對(duì)照根尖肥大，此時(shí)便可用解剖剪將根尖取下，長(zhǎng)度大約在1.5cm 左右，放入固定液中固定24h 。然后可按照常規(guī)的壓片法進(jìn)行細(xì)胞學(xué)制片，用顯微鏡觀察并計(jì)數(shù)。
3. 小麥種子的處理：先將小麥種子在清水中浸泡24h ，在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪上一塊紗布，用少許清水將紗布浸濕后將小麥種子放在上面進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)種子剛剛萌發(fā)長(zhǎng)出km 的根時(shí)，將紗布換掉，以4.0g/L 的秋水仙素替代清水在25℃下繼續(xù)培養(yǎng)，此時(shí)要注意及時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)皿內(nèi)的處理液，保證處理液的濃度不變。當(dāng)長(zhǎng)出的根出現(xiàn)膨大時(shí)就應(yīng)及時(shí)取材固定。
4. 小麥幼苗的處理：在小麥苗的幼芽長(zhǎng)到3～5mm 時(shí)，用解剖刀在芽上作一縱切，然后用一浸有秋水仙素溶液的紗布條包在切口處，紗布條的另一端浸在一個(gè)盛有秋水仙素水溶液的小燒杯內(nèi)，燒杯的口用封口膜封好以防處理液蒸發(fā)，處理12h。隔天后再處理1 次，然后將幼苗洗凈，種到花盆內(nèi)或大田中。
5. 形態(tài)觀察和細(xì)胞學(xué)鑒定：比較處理植株與對(duì)照的外部形態(tài)有什么差異。將葉面的表皮撕下，在顯微鏡下進(jìn)行觀察，多倍體植株的氣孔比二倍體大很多，葉片也比較肥厚。用根尖壓片法制成染色體載玻片標(biāo)本，在顯微鏡下認(rèn)真觀察和計(jì)數(shù)，與對(duì)照進(jìn)行對(duì)比。