葉綠體的分離與熒光觀察
實驗七 葉綠體 的分離與熒光觀察
葉綠體是植物細胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細胞器 ，光合作用就是在葉綠體中進行的, 由于具有這一重要功能，所以葉綠體一直是細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的重要研究對象。葉綠體是植物細胞中較大的一種細胞器，利用低速離心即可分離集中進行各種研究。
實 驗 目 的
1. 通過植物 細胞葉綠體的分離, 了解細胞器分離的一般原理和方法。
2. 觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光, 并熟悉熒光顯微鏡的使用方法。
實 驗 原 理
分離細胞器的常用方法是將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進行差速離心。一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞組分。
葉綠體的分離應(yīng)在等滲溶液(0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液)中進行, 以免滲透壓的改變使葉綠體受到損傷。將勻漿液1000r/min的條件下離心2min, 以去除其中的組織殘渣和未被破碎的完整細胞。然后，在3000r/min的條件下離心5min，即可獲得沉淀的葉綠體(混有部分細胞核)。分離過程最好在0~5℃的條件下進行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。
利用熒光顯微鏡對可發(fā)熒光的物質(zhì)進行檢測時，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時應(yīng)抓緊時間, 有必要時立即拍照。另外，在制作熒光顯微標本時最好使用無熒光載片、蓋片和無熒光油。
實 驗 用 品
一、器材
1.主要設(shè)備: 普通離心機、組織搗碎機、粗天平、熒光顯微鏡。
2.小型器材: 500ml燒杯2個, 250ml量筒1個, 滴管20支, 10ml刻度離心管20支, 試管架5個，紗布若干，無熒光載片和蓋片各4片。
二、材料 新鮮菠菜。
三、試劑 0.35mol/L氯化鈉溶液，0.01%吖啶橙(acridine orange)。
實 驗 方 法
一、葉綠體的分離與觀察
新鮮的嫩菠菜葉
↓
洗凈擦干去除葉梗脈
↓
取30克放入150ml氯化鈉溶液
↓
入組織搗碎機勻漿
↓
低速勻漿（5000r/min）3~5min（破碎細胞）
↓
勻漿液
↓6層紗布過濾，取4ml
1000r/min離心2min（去除組織殘渣和未被破碎的細胞）
↓取上清
3000r/min離心5min
↓保留沉淀（即混有部分細胞核的葉綠體）
用氯化鈉溶液懸浮
↓
光學(xué)顯微鏡下觀察
二、菠菜葉手切片觀察
新鮮菠菜葉
↓
刀片切出一斜面置于載玻片上
↓
滴加1~2d氯化鈉溶液
↓
蓋上蓋片顯微鏡下觀察
實 驗 結(jié) 果
一、葉綠體的分離和觀察
1. 普通光鏡下，可看到葉綠體為綠色橄欖形，在高倍鏡下可看到葉綠體內(nèi)部含有較深的綠色小顆粒，即基粒。
2. 以O(shè)lympus熒光顯微鏡為例，在先用B(bule)激發(fā)濾片、B雙色鏡和O530(orange)陰斷濾片的條件下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光。
3. 加入吖啶橙染色后，葉綠體可發(fā)出桔紅色熒光，而其中混有的細胞核則發(fā)綠色熒光。
二、菠菜葉手切片觀察
1. 在普通光鏡下可以看到三種細胞 (1)表皮細胞: 為邊緣呈鋸齒形的鱗片狀細胞; (2)保衛(wèi)細胞: 為構(gòu)成氣孔的成對存在的腎形細胞；(3)葉肉細胞: 為排列成柵狀的長形和橢圓形細胞。葉綠體呈綠色橄欖形，在高倍鏡下還可以看到綠色的基粒。
2. 在熒光顯微鏡下，葉綠體發(fā)出火紅色熒光，但其熒光強度要比游離葉綠體弱, 氣孔發(fā)綠色熒光，兩保衛(wèi)細胞內(nèi)的火紅色葉綠體則環(huán)繞氣孔排列成一圈。表皮細胞內(nèi)的葉綠體數(shù)量要比葉肉細胞少。
3. 用吖啶橙染色后，葉綠體則發(fā)出桔紅色熒光，細胞核可發(fā)出綠色熒光, 氣孔仍為綠色。
作 業(yè)
1. 根據(jù)熒光觀察結(jié)果，繪制菠菜葉的結(jié)構(gòu)模式圖。
2. 概述濾鏡系統(tǒng)的選用原則。
思 考 題
1. 葉綠體分離的實驗原理是什么？在分離葉綠體時應(yīng)注意些什么問題？
答：一個顆粒在離心場中的沉降速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的粘度有關(guān)。在一給定的離心場中，同一時間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。依次增加離心力和離心時間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細胞組分。
在分離葉綠體時應(yīng)注意操作要迅速，控制好離心速度和時間。同時棄上清時不要把沉淀蕩起，再次加氯化鈉溶液時應(yīng)用膠頭滴管吹勻混合液，力氣不能過大，以免造成葉綠體破碎。最后一次加氯化鈉溶液時應(yīng)少加，以免所得葉綠體的濃度太小，不易觀察到。
2. 普通光學(xué)顯微鏡與熒光顯微鏡有何異同點？
答：相同點：1）均為光學(xué)顯微鏡；2）均可對生物樣品進行定性和定量分析。
不同點：1）二者所用光源不同：普通光學(xué)顯微鏡用的是自然光，而熒光顯微鏡則多為紫外光；2）熒光顯微鏡含有一套特殊的濾鏡系統(tǒng)；3）熒光顯微鏡還具有靈敏度高、特異性強等特點；4）熒光顯微鏡只能使用無熒光載玻片和無熒光油等。
基復(fù)合體一般都位于細胞核附近；而高等植物中高爾基體彌散于整個細胞中，不集中。
