酵母遺傳學方法5：酵母β－半乳糖苷酶的測定
酵母 β －半乳糖苷酶的測定
1） 粗提取物測定
1． 在適當溫度下（通常 30 ℃），用適當培養(yǎng)液將 5ml 細胞培養(yǎng)物培養(yǎng)到濃度為 1 × 107 ～ 2 × 107 細胞 /ml 。如果自主復制質(zhì)粒的雜合基因表達，可使用一種適當培養(yǎng)基對存在質(zhì)粒的菌株進行篩選。
2． 在冰上冷卻細胞，離心收集。注意：以下步驟保持細胞在冰上。
3． 棄上清液，將細胞懸浮于 250 μ l 裂解緩沖液中，然后置－ 20 ℃凍結(jié)，以備的第二天測定。以下步驟均在 1.5ml 離心管中進行。
裂解緩沖液：
100 mmol/L Tris-HCl (pH8)
1 mmol/L 二硫蘇糖醇
20 ％ 甘油
4． 若細胞凍結(jié)，可在冰上將其凍結(jié)。加玻珠恰好到液面下，再加 12.5 μ l PMSF 母液。
5． 以高速振蕩混合 6 次，每次 15 秒，間歇時放在冰上。
6． 加入 250 μ l 的裂解緩沖液，用 1000 μ l 移液器插到離心管底部抽打使其充分混勻。
7． 離心 15 分鐘澄清提取物。如果活性成分存在于顆粒狀碎片中，則可用未澄清的上清液，而測定的混合物將在步驟 8 澄清。
8． 測定：
a. 加 10 ～ 100 μ l 抽提物到 0.9ml 的 Z 緩沖液中，用裂解緩沖液定容至 1ml 。
Z 緩沖液：
16.1 g Na2 HPO4 ? 7H2 O
5.5 g NaH2 PO4 ? H2 O
0.75 g KCl
0.246 g MgSO4 ? 7H2 O
2.7 ml β - 巰基乙醇
用蒸餾水定容至 1 升
調(diào) pH 至 7.0 ，保存于 4 ℃
b. 在 28 ℃水浴中將混合物保溫 5 分鐘。
c. 加入 0.2ml 臨硝基苯 - β -D 半乳吡喃糖苷（ ONPG ）母液，開始反應，注意準確時間，在 28 ℃下保溫至混合物產(chǎn)生淡黃色。
d. 加入 0.5ml 碳酸鈉母液終止反應，注意準確記錄反應終止的時間，在 420nm 波長下測定光密度。
9． 采用 Bradford （ 1976 ）染料結(jié)合測定法測定抽提物中的蛋白質(zhì)濃度。
a. 用蒸餾水將 Bradford 試劑稀釋 5 倍。用 Whatman540 號濾紙過濾稀釋試劑。
b. 加 10 ～ 20 μ l 抽提物到 1ml 稀釋試劑中，并混合。在 595nm 波長下測定形成的藍色溶液。用一次性塑料比色杯以防止形成藍膜影響測定結(jié)果。
c. 將 BSA 溶解于裂解緩沖液中，選用幾個不同稀釋度（ 0.1 ～ 1mg/ml ）制成標準曲線。
10． 根據(jù)下面公式計算抽提物的特異活性：
OD420 × 1.7
0.0045 ×蛋白質(zhì)×抽提物體積×時間
2） 通透細胞測定法
1． 按上述方法培養(yǎng)細胞，測定培養(yǎng)物的 OD600 ，當培養(yǎng)物細胞密度達 1 × 106 ～ 1 × 107 細胞 /ml ，同方法 1 離心收集細胞。
2． 棄上清液，將細胞懸浮于 1ml Z 緩沖液中。
3． 加入 3 滴氯仿和 2 滴 0.1 ％ SDS ，高速振蕩 10 秒鐘。
4． 28 ℃下預保溫樣品 5 分鐘，同方法 1 加入 0.2ml ONPG 開始反應。
5． 當試管中的樣品變?yōu)榈S色時，加入 0.5ml 碳酸鈉母液終止反應。注意在測定時所花時間，離心 10 分鐘，棄細胞碎片和沉淀物。
6． 測定反應物 OD420 的光密度。
7． β - 半乳糖苷酶的活性單位為：
OD420
培養(yǎng)物 OD600 的光密度×測定體積×時間
