瘢痕組織中成纖維細胞培養(yǎng)

方案1
1．細胞培養(yǎng)材料：取病人手術(shù)切下的病理性瘢痕組織及其周圍正常組織。
2.取材部位：前胸、四肢等，病人年齡從3到35歲，瘢痕生長時間為6個月到1.5年。
3.采取組織塊貼壁法進行成纖維細胞培養(yǎng)。
4．過程：在手術(shù)室無菌條件下將手術(shù)切下的病理性瘢痕及周圍正常組織小心去除表皮及皮下脂肪組織，然后在超凈工作臺上用眼科剪刀將組織剪成大小約 0.5-1mm3的小塊，加入少量小牛血清，接種于培養(yǎng)瓶中，在95%空氣,5%CO2, 37°C, 飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時，使組織塊牢固貼附于瓶壁。 然后加入適量含20%小牛血清、100U/ml青霉素、100ug/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每周兩次換液。
約3-4周，原代培養(yǎng)細胞生長成細胞單層。用0.25%胰蛋白酶消化以后，以1：2的比例傳代培養(yǎng)。每隔兩天用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液換液一次，待細胞鋪滿瓶底后傳代。實驗選用3-10代細胞。

方案2
1. 1 　材料　瘢痕組織:醫(yī)院整形或燒傷科或燒傷科提供。DMEM 培養(yǎng)液(美國Gibco 公司產(chǎn)) ;小牛血清
1. 2 　方法　手術(shù)切取病人的瘢痕組織,在無菌條件下立即置入DMEM 培養(yǎng)液(含10 %FCS、青霉素100 U/ ml ,鏈霉素100μg/ ml) 的培養(yǎng)瓶中,于4 h 內(nèi)在凈化工作臺內(nèi)取出標本,放入加有青- 鏈霉素的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液中清洗2 次,盡量去除血污及表皮與基底層,將清洗干凈的瘢痕組織用眼科剪剪成0. 5～1 mm3 的小塊,分別轉(zhuǎn)入2 支試管內(nèi),然后分步消化培養(yǎng): ①單細胞培養(yǎng)法:將試管內(nèi)組織用Hanks’液洗2 次,吸出上清,加入5 ml 0. 25 %胰蛋白酶液,置37 ℃消化20～30 min (或加入5ml 0. 1 %胰蛋白酶液,置4 ℃冷消化過夜) ,加入2 ml 小牛血清終止消化,去上清液,加入10 ml DMEM 完全培養(yǎng)液,用吸管將組織吹打成單個細胞懸液,200 目不銹鋼篩過濾,離心去上清,Hanks’液洗2 次,加入DMEM 完全培養(yǎng)液,將細胞充分打勻,以5 ×105 細胞接種于50 ml 培養(yǎng)瓶內(nèi),置37 ℃、含5 %CO2 、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2～3 d 更換一次培養(yǎng)液; ②組織塊貼壁培養(yǎng)法:分胰蛋白酶消化組及未消化組,消化組用0. 15 %胰蛋白酶液將組織塊消化5～10 min ,去消化液, Hanks’液洗2次,去上清,加入含20 %FCS 的完全DMEM 培養(yǎng)液4～6 ml (視組織塊量多少而定) ,混勻,靜置數(shù)分鐘,棄上清,然后用彎頭吸管將消化或未消化的組織塊移入用FCS 濕潤過的培養(yǎng)瓶底部,均勻散在貼壁,滴加少量的完全培養(yǎng)液,置37 ℃、含5 %CO2 、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3 d 以后再補救加2 ml 完全培養(yǎng)液,此后3～4 d 更換一次培養(yǎng)液,待纖維細胞長滿瓶底時作傳代培養(yǎng)。