流式細胞術定量檢測細胞凋亡3種方法的比較研究
細胞凋亡的定性檢測依賴于形態學觀察及DNA電泳,其定量檢測則需借助于流式細胞檢查。使用碘化丙啶(PI)染色檢測DNA含量是最早出現的凋亡定量檢測方法［1］ 。進入90年代,檢測DNA斷裂點的TUNEL(Terminal deoxylnucleotidyl transferase mediated-dUTP nick end labeling)技術成為凋亡定量檢測的主流。1995年Vermes 首次使用熒光素標記的膜聯蛋白V(FITC- Annexin V)聯合PI染色雙參數技術定量檢測凋亡，目前國內尚未見報道［2］ 。我們同時使用上述3種方法對地塞米松處理的小鼠胸腺細胞進行凋亡檢測對比研究，借以探討這一新的方法的應用價值，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 材料 4周齡雄性昆明小鼠12只。PI(Sigma)。TUNEL試劑盒(德國Boehringer Mannheim)。Annexin V/PI試劑盒(法國國際免疫公司)。流式細胞儀(FACScan型 美國BD公司)。
1.2 方法
1.2.1 動物模型及細胞制備 10只小鼠腹腔注射地塞米松25 mg/kg，2只小鼠腹腔注射生理鹽水作為對照。10 h后取胸腺，網搓法分離胸腺細胞。PBS洗2遍后調細胞濃度2×106 ml-1 ，備用。
1.2.2 PI染色法 取2×106 細胞,加入80%冷乙醇，4℃ 30 min，PBS洗1次，加入PI 50 mg/ml，0.1%TritonX-100，0.1 mmol/L EDTA(Na)2 ，RNase 50 μg/ml。置黑暗處1 h后檢測。
1.2.3 TUNEL法 取2×106 細胞，1%多聚甲醛冰上固定15 min,離心去上清,70%冷乙醇固定24 h。然后按試劑盒說明操作。
1.2.4 Annexin V/PI法 取490 μl細胞加入5 μl FITC-Annexin V及5 μl PI(濃度250 μg/ml)，混勻置冰浴暗處溫育10 min，PBS洗2遍，上機分析。
1.2.5 流式細胞儀分析 光源為488 nm氬離子激光器，FITC受激發后發綠色熒光，PI發紅色熒光,每份標本收集10 000個細胞,然后在Macintosh650計算機上用相關軟件分析數據,用HP-Deskjet 1600CM打印機打印結果。
2 結果
2.1 PI檢測法 在正常二倍體細胞DNA峰(G1峰)前出現一亞二倍體凋亡峰,稱Ap峰(圖1)。
2.2 TUNEL檢測法 根據FITC-dUTP摻入量的多少區分正常及凋亡細胞(圖2)。
2.3 FITC-Annexin V/PI檢測法 正常細胞FITC及PI均低染(FITC- PI- )，在流式細胞分析圖上為R1 區細胞簇。凋亡細胞FITC高染而PI低染(FITC+ PI- )，圖上顯示為R2 區細胞簇。死亡細胞FITC及PI均高染(FITC+ PI+ )，圖上顯示為R3 區細胞簇(圖3)。
圖1 PI染色法胸腺細胞FACS測定圖
Fig.1 Cytometric diagram of PI staining of mouse thymocytes
圖2 TUNEL法胸腺細胞FACS測定圖
Fig.2 Flow cytometric diagram of mouse thymocytes using TUNEL assay
Note:A peak.normal cells;B peak.apoptotic cells
圖3 Annexin V/PI 雙參數法胸腺細胞FACS測定圖
Fig.3 Flow cytometric diagram of Annexin V/PI staining of mouse thymocytes
Note:A peak.normal cells;B peak. apoptotic cells+necrotic cells;C peak. normal cells+apoptotic cells;D peak. necrotic cells;R1 . normal cells;R2 .apoptotic cells;R3 . necrotic cells
2.4 PI、Annexin V/PI、TUNEL 3種方法凋亡檢出率對照組分別為0、13.12%、1.24%。地塞米松處理組分別為27.19%、32.28%、50.17%,三者之間均有顯著差異(P＜0.01),Annexin V/PI法死亡檢出率13.25%,其凋亡+死亡檢出率為45.62%,與TUNEL法凋亡檢出率無顯著差異(P＞0.05)。
2.5 相關分析發現TUNEL法凋亡檢出率與Annexin V/PI法凋亡檢出率兩者相關系數0.63,P＜0.05，與Annexin V/PI法凋亡＋死亡檢出率二者相關系數為0.7,P＜0.05。
3 討論
近年來有關凋亡信號轉導、基因調控等方面的研究已取得重大進展,但作為所有研究基礎的凋亡定量檢測技術卻進展不大。選用何種凋亡檢測技術已成為研究的關鍵。
凋亡定量檢測常需借助流式細胞檢查。最早出現且較為常用的流式細胞凋亡定量檢測技術是PI染色法。細胞凋亡時DNA斷裂成小片段，當細胞用乙醇、TrionX-100處理后，這些小片段從細胞內釋放出來，使其DNA含量低于正常細胞的二倍體。用DNA結合染料PI染色后分析，可在G1峰前出現一亞二倍體峰即Ap峰。根據Ap峰的百分率可檢測凋亡細胞數。在本組研究中PI法凋亡檢出率為27.19%,顯著低于TUNEL法及Annexin V/PI法。其檢出率低的原因主要是凋亡早期盡管有DNA裂點形成，但尚未出現DNA片段的大量丟失，因此該法不能檢出早期凋亡細胞。次要原因是發生于S期或G2 /M期的凋亡細胞，即使有DNA含量降低，其實際含量也不低于二倍體細胞所含的DNA。國內李莉報道采用與本文同一動物模型PI漏檢率高達42.8%。此外PI法還存在錯檢，一部分壞死細胞碎片發生低熒光，位于二倍體峰前，造成PI法錯檢。據李莉報道錯檢率達21.3%，因此我們認為PI染色定量檢測凋亡并不理想。
目前國內外最為常用的凋亡定量檢測方法是檢測DNA斷裂點的TUNEL法。在TDT作用下將FITC-dUTP摻入DNA裂點的3′ -OH端上，根據其摻入量的多少計算凋亡細胞百分比。由于DNA斷裂發生在凋亡早期，因此該法可檢出早期凋亡細胞，具有較高靈敏性。但該法最大缺點是壞死細胞亦呈現TUNEL反應陽性，使其特異性降低［3］ 。本研究TUNEL凋亡檢出率為50.17%，顯著高于其它二法。我們認為這既與其較高的靈敏性有關亦與其較低的特異性有關。為證實此點我們作了進一步研究,結果發現TUNEL凋亡檢出率與Annexin V/PI中凋亡＋死亡檢出率無顯著差異，相關分析亦提示TUNEL凋亡檢出率實際更能反映凋亡＋死亡檢出率。
1992年Fadok 報道在細胞凋亡早期位于細胞膜內側的磷酯酰絲氨酸(PS)遷移至細胞外側［4］ 。1995年Vermes利用對PS有高度親合力的磷脂結合蛋白Annexin V檢測凋亡細胞。由于壞死細胞PS亦暴露于外表使Annexin V結合陽性，因此必須同時采用PI這一壞死細胞染色陽性的DNA染料將壞死細胞區分出來。與PI法檢測凋亡不同的是該法不需要固定細胞，因此凋亡細胞PI低染。本資料表明使用Annexin V/PI雙參數法可將正常細胞、凋亡細胞、死亡細胞區分開來，其凋亡檢出率更有特異性。細胞發生凋亡時膜上PS外露早于DNA斷裂發生［2］ ，因此該法檢測早期凋亡優于TUNEL法及PI法。現已明確胸腺細胞可自發發生凋亡［5］ ，但本資料對照組PI法未檢出凋亡，TUNEL法檢出率僅為1.24%，而Annexin V/PI法檢出率13.12%,這亦證實該法可檢出早期凋亡因而具有更大的靈敏性。該法另一優點是細胞不需要固定，避免了PI法因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此更加省時，結果亦更為可靠。
綜上所述,我們認為Annexin V/PI法既可檢測早期凋亡,又可將凋亡及死亡細胞區分開來，較PI、TUNEL具有更高的靈敏性及特異性。且不需固定，省時省力，應是目前流式細胞儀定量檢測凋亡的首選方法。
作者簡介：鄭駿年，男，32歲，泌尿外科碩士；
指導教師，謝叔良，男，教授，從事腫瘤及移植耐受研究
參考文獻
1 Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci M C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry . J Immunol Methods， 1991;139:271
2 Vermes I, Haanen C, Steffens-Nakken H et al. A novel assay for apoptosis.Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptosis cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods，1995; 184:39
3 Gorczyca W, Gong J P, Darzynkiewicz Z.Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assay . Cancer Res，1993;53:1945
4 Fadok V A, Voelker D R,Campbell P A et al. Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophage . J Immuol， 1992;148:2207
5 郭愛珍. 胸腺細胞的發育與凋亡.細胞與分子免疫學雜志， 1997；13(1):61
