酵母遺傳學(xué)方法9：酵母免疫熒光
酵母免疫熒光
1 ）細(xì)胞制備
1． 培養(yǎng) 5ml 酵母至對數(shù)生長早期（ 106 ～ 107 細(xì)胞 /ml ）。
2． 直接加 1/10 體積的甲醛到培養(yǎng)基里固定細(xì)胞（加入的甲醛終濃度為 3.7 ％，標(biāo)準(zhǔn)母液是 37 ％）。
3． 細(xì)胞在甲醛中培養(yǎng)至少 1 小時。
4． 離心收集細(xì)胞，用 0.1mol/L 磷酸鉀（ pH7.5 ）洗一次。
5． 把細(xì)胞懸浮在 1ml 的 50mg/ml 消解酶 100T 或 50 單位 /ml 的溶細(xì)胞酶 [ 溶于含有 2ml/ml 6- 巰基乙醇的 0.1mol/L 的磷酸鉀溶液中 ] 。
6． 置 30 ℃培養(yǎng) 30 分鐘，用相差顯微鏡檢查原生質(zhì)的生成率。細(xì)胞應(yīng)呈黑色或半透明灰色，亮細(xì)胞（折射體）屬于沒有充分被消化的。菌蛻屬消化過夜。
7． 離心收集細(xì)胞，懸浮在 1ml 的 PBS 中。
2 ）染色
1． 取 10ml 的 1mg/ml 聚賴氨酸，放到用特氟隆封閉的（ Teflonmasked slides ）載玻片（ 10 孔載玻片）上的每個孔，再用蒸餾水洗載玻片，干燥。
2． 放 10ml 固化細(xì)胞到每個孔中，幾分鐘后，用 PBS 抽洗 3 次。用顯微鏡檢測載玻片確保呈合適的密度而不聚集。
3． 該步驟可任選（本實驗不需要使用抗體，但建議使用）：把載玻片浸泡在冷甲醇（－ 20 ℃） 6 分鐘后，然后放到冷丙酮（－ 20 ℃） 30 秒，該處生理產(chǎn)生扁平細(xì)胞，有助于細(xì)胞骨架的觀察。對于一些抗體 - 抗原結(jié)合物，需要這些步驟重新活化，用 PBS 重新潤濕玻孔。
4． 加 15ml 由 PBS ＋ 3 ％ BSA （牛血清白蛋白）組成的阻斷緩沖液到玻孔中。在保濕盒子中，如墊有濕紙巾的平板中保溫 30 分鐘。重要的是，在這期間不能讓載玻片孔干透（ BSA 可通過阻斷蛋白質(zhì)結(jié)合位點降低非特異抗體結(jié)合到載玻片）。
5． 吸出阻斷緩沖液，用 PBS ＋ 3 ％ BSA 洗兩次。
6． 加 10 ～ 15ml 第一抗體（溶解在 PBS ＋ 3 ％ BSA ）到載玻片孔中，在一個保濕盒中保溫 1 小時。用親和純化抗體或單克隆抗體，如果可能，用缺乏目的抗原的同源對照。作一個沒有第一抗體的對照也是有幫助的。
7． 吸出第一抗體，用 PBS ＋ 3 ％ BSA 洗 3 次。
8． 用熒光第二抗體重復(fù)第 6 ～ 7 步（在暗處培養(yǎng)）。
9． 吸出第二抗體，用 PBS ＋ 3 ％ BSA 洗 3 次。
10． 加 10 ～ 15ml 的 1 μ g/ml DAPI 到載玻片孔中，培養(yǎng)約 1 分鐘，用 PBS 洗 3 次。
11． 吸出 PBS ，給每個孔加一小滴封固劑，放蓋玻片，避免在孔中出現(xiàn)氣泡。用紙巾除去多余的封固劑，小心不要移動蓋玻片，用干凈的指甲油密封，－ 20 ℃下保存。
