細胞生物基本方法：上皮細胞培養
上皮細胞培養
1 ）表皮細胞培養
1． 取材：取外科植皮或手術殘余皮膚小塊，以角化層薄者為佳，早產流產兒皮膚更好，切成 0.5 ～ 1 平方厘米小塊。
2． EDTA 處理：先置入 0.02 ％ EDTA 中室溫置 5 分鐘。
3． 冷消化：換入 0.25 ％胰蛋白酶中，置 4 ℃過夜。
4． 分離：取出皮膚，用血管鉗或鑷子把表皮與真皮層分開。
5． 溫消化：取出表皮單獨處理，用剪刀剪成更小的塊后，置入新的 0.25 ％胰蛋白酶中， 37 ℃再消化 30 ～ 60 分鐘。
6． 用吸管輕輕反復吹打，使成細胞懸液。
7． 培養液：通過 80 目不銹鋼紗網濾過后，低速離心，吸上清，直接加入 Eagle 液和 20 ％小牛血清，制成細胞懸液，接種入碟皿中， CO2 溫箱培養。
2） 乳腺組織培養
直接培養法：（適于培養含纖維少的軟組織）
1． 在含有少量培養液或 Hanks 液的容器中，用鋒利刀片將組織反復切割成碎塊。
2． 把組織碎塊連同液體注入離心管中，再補加少許培養液，用吸管吹打片刻，置試管架 3 ～ 5 分鐘。吸除上層液可排除非乳腺細胞部分。重復 2 ～ 3 次。
3． 末次處理結束后，向沉降管中再補加培養液，用吸管稍吹打，使沉降物重懸。不待細胞團塊下降立即通過 3 ～ 4 層無菌紗布濾入另管中。
4． 調整好適宜密度，接種入培養瓶中培養。
膠原酶消化法：（適于處理含纖維多的較硬組織）
其過程與培養其它組織相同。
3） 胃上皮細胞培養
1． 取材：取胃潰瘍或胃癌手術切除胃標本遠端非病變區粘膜少許。
2． 清洗：用含慶大霉素（ 400 微克 / 毫升）和二性霉素（ 2 微克 / 毫升的 Hanks ）液漂洗后，用鈍器剝離下粘膜，剪成 1mm3 大小。
3． 消化：在 I 型膠原酶和透明質酸酶中，于 37 ℃中消化 80 分鐘。
4． 離心：收集細胞懸液， 800 轉 / 分離心后， Hanks 液漂洗兩次。
5． 接種：末次離心后加入含有 1 ％～ 2 ％胎牛血清的完全培養基，接種入不同孔數的培養板中，接種量依不同實驗目的而定。
4） 肝細胞培養
初代組織塊培養：
取新鮮肝臟，先剝除被膜和血管等纖維成分，用刀或剪刀把肝臟剪成 1mm3 左右的小塊，采用帖壁培養法。
初代消化法培養：
1． 把肝組織切成 2 ～ 4 立方毫米的小塊，用不含鈣鎂的 BSS 液洗兩次。
2． 移入 1 ： 1 的 0.1 ％胰蛋白酶和 0.1 ％膠原酶（都用無鈣鎂 BSS 配置）中， 4 ℃冷消化 10 ～ 12 小時后，通過 250 微米和 64 微米尼龍網或不銹鋼紗網濾過。
3． 收集細胞、 BSS 液洗 1 ～ 2 次、計數、接種培養。
消化培養肝細胞的另一種方法是灌流法；肝臟灌流需用全肝，以較小動物如小鼠和大鼠為好。
1． 無菌解剖動物，取出肝臟，先用 BSS 洗除血污。
2． 取 5ml 注射器一支，吸取消化液后，把注射器頭輕輕插入肝管中，用線繩結扎牢固，以防消化液漏出，輕輕把消化液注入肝管系統，并不時輕揉壓肝臟，以便消化液進入肝小葉中；消化液在肝內停留 20 ～ 30 分后，在吸出消化液的同時并輕揉壓肝臟，以使肝細胞脫落和消化液吸出。
3． 待吸凈消化液后，注入離心管中，低速離心分離，用 RPMI 1640 培養基培養（較其它培養基為好），能獲得較純的肝上皮細胞和獲較好的效果。
傳代培養：
待細胞生長連接成片后，用 BSS 洗一二次，加 1 ： 1 的 0.025 ％胰蛋白酶和 0.02 ％ EDTA 混合消化 3 ～ 5 分鐘，待細胞回縮，便停止消化，棄掉消化液，用 BSS 洗一二次，注入營養液，吹打，制成細胞懸液，再接種培養。
5 ）內皮細胞培養
1． 取產后的新鮮臍帶。如不立即培養可以保存于 4 ℃中，但不宜超過 12 小時。無菌剪取長 10 ～ 15 厘米一段。其它如胚胎和幼體動物的大血管，亦可用于培養。
2． 先用三通注射器吸溫 PBS 液注入臍帶的靜脈中，洗除殘血，注入口處宜用線繩結扎，以防液體返流。
3． 用血管鉗夾緊臍帶一端，從另端向臍靜脈中徐徐注入最終濃度為 0.1 ％的膠原酶，待末端出現液體后結扎之，令充滿血管，注入口亦應結扎，以防液體返流，消化 3 ～ 10 分鐘。
4． 吸出含有內皮細胞的消化液，注入離心管中，為獲取更多細胞，可再注入溫 PBS 沖洗 2 ～ 3 次徹底清除干凈殘余細胞，一并注入離心管中離心。
5． 吸除上清，加 1640 培養液，制成細胞懸液，接種入瓶皿中培養，順利時 2 ～ 3 天內細胞即可長成單層。
6 ）毛細血管內皮細胞培養
腫瘤條件培養基制備：
1． 取 C3 H 小鼠的 S-180 實體肉瘤組織。
2． 胰蛋白酶消化， Dulbecco 改良 Eagle 氏培養液 15ml （含 10 ％小牛血清），接種到 T-75 Falcon 產培養瓶中培養。
3． 在細胞生長接近完全匯合時，收集培養液制成條件培養基；再用含 10 ％小牛血清的新培養液后，也每隔兩天收集一次，可獲得多量條件培養基。
4． 4000 轉 / 分離心后，再通過 0.22 μ m 微孔濾膜濾過，－ 20 ℃凍存備用（臨用前融解）。
初代培養：
1． 取材：取新鮮牛腎上腺數個，先用 Hanks 液洗除血污。
2． 剝除被膜，分離出皮質，切成 1 立方毫米小塊，加 0.5 ％膠原酶室溫中消化 1 小時，每隔 10 分鐘用吸管吹打懸液令消化充分。
3． 通過不銹鋼紗網濾過，網眼要求只允許能通過小于 110 微米長的毛細血管小段。
4． 650rpm ， 4 ℃，離心 7 分鐘后，棄掉上清膠原酶。
5． 沉淀物用培養液重懸并離心，再重懸，再離心，共兩次。
6． 末次沉淀物仍用含有 10 ％小牛血清的 Dulbecco 改良 Eagle 氏培養液重懸后，稍吹打。
7． 接種于鋪有明膠底層的培養皿中， 37 ℃培養，在培養頭 1 ～ 3 小時中，毛細血管小段和內皮細胞最先帖附于底物上，而腎上腺細胞和成纖維細胞卻仍在培養液中漂浮。
8． 趁此時，吸除培養液，再加入腫瘤條件培養液，每兩天換液一次。毛細血管小段一般成自 1 ～ 4 個內皮細胞，以后每個小段在底物上慢慢展成特殊形態的細胞島，能持續 2 ～ 5 天。
毛細血管內皮細胞分離培養：
1． 初代培養 2 ～ 3 天后，鏡下確認幾個毛細血管內皮細胞島，在培養皿背面，用不脫色筆劃圈圈起。
2． 鏡下檢查，如圈內殘有非內皮細胞時，可用顯微細針在倒置顯微鏡下挑除。此操作用細胞解剖器或用手操作均可，宜在凈化臺無菌氣流中、打開培養皿蓋進行，但時間不宜過長（ 15 ～ 20 分鐘），圈內非內皮細胞可用無菌膠刮除。
3． 用培養液漂洗兩次，以去除漂浮細胞。
4． 剩余內皮細胞島如小（ 5 ～ 20 個細胞）而少時，生長增值變得緩慢或不完全不生長，此時需加入 3T3 等飼細胞，飼細胞接種量為 4000 細胞 /cm2 。
5． 當內皮細胞充滿所有飼細胞空間后，用胰蛋白酶消化、離心、加入腫瘤條件培養基。
6． 接種入明膠底物皿中繼續培養（飼細胞死亡淘汰），細胞增殖生長匯合后，按 1 ： 5 傳代。
