Rockland Dr.Moncada 分享： 如何獲得更漂亮的流式結果

1. 如何降低背景
流式細胞實驗優(yōu)化過程中的一個關鍵步驟是試劑（抗體）的滴定。為了達到最佳效果，實驗者必須確定抗原結合達到飽和所需抗體的最低量。這將幫助實驗者提高熒光信號特異性和強度，同時盡量降低背景。如果需要同時使用多色時，滴定這一步驟也可以讓實驗者發(fā)現一抗和二抗之間意想不到的交叉反應。

2. 如何選擇對照

千萬記得設置與標記抗體同型的陰性對照，實驗者可以通過該對照確定實驗背景的信號強度。尤其是直標一抗或一抗和PE（phycoeryhtrin）標記的二抗組合時尤為重要。

為獲得最佳效果，請設立未染色的細胞樣品組（與染色樣品同時培養(yǎng)），這樣便于控制由于自發(fā)熒光而產生的背景。有可能的話，用已知表達目的抗原的細胞以及已知缺乏目的抗原的細胞，將有助于確定所用抗體的特異性。

3. 優(yōu)化通透和固定步驟，從而提高胞內蛋白的檢測效率
檢測細胞內的目的蛋白更具有挑戰(zhàn)性，因為它們具有超出抗體特異性的額外的要求，包括成功穿過可透細胞膜的能力。細胞固定和通透的優(yōu)化是需要憑經驗的一項重要環(huán)節(jié)，目的是平衡胞內結構的完整性與細胞通透性。

使用新鮮配制的高純度低聚甲醛用于固定，并開始加入溫和去污劑（即吐溫20）用于通透。如果需要進一步改進固定和透化步驟，請逐漸提高甲醛濃度到4％或嘗試乙醇或甲醇，并使用其它洗滌劑包括的Triton X-100，或在沒有固定或酒精固定情況下使用皂甙。

4. 死細胞染色，為獲得更有意義的活細胞數據
由于死細胞可以非特異性的結合任何抗體，因此這些數據必須從有效數據中去除。要做到這一點，最好的方法是使用某種熒光染料，通過受損的細胞膜，將死細胞染色。在大多數情況下，尤其是做細胞內指標染色實驗時，這種染料最好是共價結合來染色死細胞，而不會因為細胞通透而泄漏。

5. 保持高熒光強度

當進行的細胞表面標記物染色時，請注意胞外抗原由于抗體結合而內化的現象。這種自然發(fā)生的現象可以對你的熒光信號的強度產生顯著的負面影響，但可以通過下面方法改善：

①使用無聚合抗體的溶液；

②將樣本始終放在冰上或冰箱里；

③使用含疊氮鈉的染色緩沖液，確保染色時細胞代謝活性降低。也可考慮使用F(ab)片段這種形式的單價抗體。