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草酸青霉WX-209的安全性評(píng)估
發(fā)布日期:2023-12-29 08:58:29


草酸青霉WX-209的安全性評(píng)估

1 Introduction

在果汁和罐頭生產(chǎn)中,去除果肉表皮包裹的囊衣是一大難題。常用的方法包括酸堿法,但會(huì)產(chǎn)生囊衣碎片殘留物,影響產(chǎn)品的感官和口感,還有物理或機(jī)械剝離的方法,但其不僅耗費(fèi)人力,效率低下,還會(huì)破壞果肉完整性。無(wú)法滿足無(wú)害環(huán)境和節(jié)約資源的需求,許多物理或化學(xué)處理已逐漸被生物處理所取代。微生物潛力巨大,因其相對(duì)便宜,高效和環(huán)保的特性而引起廣泛關(guān)注。

多種研究已經(jīng)探索了青霉菌與纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的產(chǎn)生有關(guān),例如P. oxalicum 114-2、P. Arizona、P. echinulatum等。絲狀真菌及其主要分泌物,特別是水解酶包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等,可用于食品生產(chǎn)、有機(jī)合成、化妝品和動(dòng)物飼料制造以及各種行業(yè)。青霉菌的酶由于其基因組特性而被用于實(shí)際應(yīng)用,草酸青霉菌屬經(jīng)研究有利于產(chǎn)生果膠酶,果膠裂解酶和果膠酯酶等多種酶,并提高葡萄汁,橙汁和蘋果汁的產(chǎn)量。

然而,酶法脫皮在食品中并沒(méi)有得到廣泛應(yīng)用,部分原因是其安全性不能保證或效果不好。在果汁生產(chǎn)中,果皮碎屑或沉淀物的出現(xiàn)會(huì)影響果汁澄清度。一些青霉菌屬會(huì)產(chǎn)生霉菌毒素,其對(duì)動(dòng)物生殖系統(tǒng)有毒,會(huì)致癌和致突變。有些酶法脫皮需要結(jié)合物理?xiàng)l件才能發(fā)揮更好的效果,如機(jī)械剝離和真空灌注等。因此,找到一種能夠安全有效地達(dá)到更好剝離效果的高產(chǎn)復(fù)合酶是一項(xiàng)重要的任務(wù)。

本文探討了從生物質(zhì)廢棄物中分離出的草酸青霉WX-209的粗酶液安全性以及其降解柑橘囊衣的能力,并通過(guò)全基因組測(cè)序預(yù)測(cè)了其產(chǎn)生酶的基因片段,研究了與纖維素和半纖維素降解相關(guān)的基因。這是為了了解用于食品生產(chǎn)過(guò)程中的草酸青霉WX-209的酶生產(chǎn)能力。同時(shí),也實(shí)現(xiàn)了生物廢棄物的綜合利用。觀察其產(chǎn)生的粗酶液對(duì)柑橘囊衣的降解作用,通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估粗酶液的安全性,為果蔬生產(chǎn)工藝中低成本、高效、安全的酶去皮法的實(shí)現(xiàn)提供了依據(jù)。

2 Results and Discussion

2.1 柑橘囊衣降解

草酸青霉WX-209粗酶液能有效地降解柑橘囊衣。柑橘囊衣在處理過(guò)程中隨著時(shí)間的推移而溶解和消失,柑橘囊衣的果肉明顯暴露。柑橘囊衣的細(xì)胞壁在初始結(jié)構(gòu)致密,細(xì)胞間隔均勻。10 min后,盡管細(xì)胞保持一定的排列順序,但細(xì)胞壁被破壞,細(xì)胞間物質(zhì)減少并且密度降低。20 min后,邊緣開(kāi)始溶解,細(xì)胞變形并融合,細(xì)胞間質(zhì)顯著溶解。30 min后,細(xì)胞失去完整性,細(xì)胞內(nèi)容物泄漏出來(lái)。40 min后,細(xì)胞分解,纖維變薄并分散。50 min后,剩余的完整囊衣很少。柑橘囊衣主要由纖維素,半纖維素,果膠等組成,這一系列的變化證實(shí)了該種粗酶液在柑橘囊衣降解中的有效性,有效地降解了柑橘囊衣的細(xì)胞壁,表明它含有相關(guān)的降解酶。

2.2 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

為了探討草酸青霉WX-209所產(chǎn)酶在柑橘罐頭加工應(yīng)用中的安全性,進(jìn)行了毒理學(xué)測(cè)試。灌胃粗酶液結(jié)束后連續(xù)觀察14 d小鼠未見(jiàn)異常反應(yīng)及死亡,試驗(yàn)結(jié)束對(duì)小鼠進(jìn)行解剖,肉眼觀察主要臟器表面和切面均未見(jiàn)明顯異常情況。酶液組與空白對(duì)照組比較,給受試物前后動(dòng)物體質(zhì)量無(wú)明顯差異(P>0.05);在第4、7、10、14 天,酶液組動(dòng)物體質(zhì)量與空白對(duì)照組相比,差異不顯著(P>0.05)。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核和精子畸形試驗(yàn)

陽(yáng)性對(duì)照組按40mg/kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺,各受試物給粗酶液體積均為20 mL/kg,高劑量組均灌胃給予原液,中劑量組劑量為高劑量的1/2,低劑量組劑量為高劑量的1/4,空白對(duì)照組給予純水。酶液各劑量組小鼠骨髓細(xì)胞微核率與空白對(duì)照組比較,無(wú)顯著差異(P>0.05),陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01),各劑量組PCE/NCE比值未小于空白對(duì)照組的20%,表明酶液對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞未見(jiàn)明顯毒性。酶液各劑量組小鼠精子畸形率分別與空白對(duì)照組比較,無(wú)顯著差異,陽(yáng)性對(duì)照組與空白對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)。

2.4 亞慢性毒性試驗(yàn)

進(jìn)行30 d口服毒理學(xué)測(cè)試,以評(píng)估粗酶液對(duì)各器官系統(tǒng)的慢性毒性作用。在喂養(yǎng)的30 d內(nèi),酶液組小鼠的生長(zhǎng)狀況良好。動(dòng)物體質(zhì)量、食物利用率、每周總食物利用率均與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)。同樣,酶溶液組的異常行為和中毒癥狀、血液學(xué)和血液生化指標(biāo)與對(duì)照組相比也沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。盡管中性粒細(xì)胞(Neu)和淋巴細(xì)胞(Lym)的比例分別略高于和低于對(duì)照組,但在正常范圍內(nèi)。肝臟、腎臟、脾臟、睪丸的重量及臟體比值與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5 全基因組測(cè)序和組裝

使用PacBio RS系統(tǒng)和Illumina MiSeq技術(shù)的組合對(duì)草酸青霉WX-209的基因組進(jìn)行測(cè)序。基因組的一般特征的分析,最終組裝的WX-209的完整基因組序列以36618721個(gè)堿基對(duì)的基因組大小表示,并組裝成45個(gè)支架,GC含量為48.33%。100%鑒定的基因在NR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了注釋,74.84%(8508)和79.52%(9041)的基因分別在Swiss-prot和Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了注釋。此外,根據(jù)COG分析,86.32%(9814)基因被注釋為不同的功能類別。根據(jù)GO注釋,將8270個(gè)基因(72.74%)分為三組。根據(jù)京都基因與基因組百科全書(KEGG)分析,4708個(gè)基因(41.41%)被劃分為不同的代謝途徑。

2.6 草酸青霉WX-209所產(chǎn)酶相關(guān)的功能基因注釋

對(duì)WX-209的COG分析將9814個(gè)基因分為24個(gè)不同的類別,如圖5所示。WX-209的主要類別是碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(G,6.95%),氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝(E,5.61%),翻譯后修飾,蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn),表達(dá)(O,4.97%),轉(zhuǎn)錄(K,4.94%),翻譯,核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成(J,4.24%),能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化(C,3.96%),復(fù)制,重組和修復(fù)(L,3.76%),細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸,分泌和轉(zhuǎn)運(yùn)(U,3.62%)。特別是,與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的碳水化合物運(yùn)輸和代謝(G)中的基因數(shù)量為682個(gè),其中最豐富的COG是COG0176,其對(duì)戊糖-磷酸途徑中代謝物的平衡很重要,功能注釋的高度多樣性表明, WX-209具有纖維素降解的潛力。

在GO分類分析中,8270個(gè)預(yù)測(cè)蛋白,6369,5143,6150個(gè)蛋白與分子功能,細(xì)胞成分和生物過(guò)程密切相關(guān)。與碳水化合物代謝水解酶相關(guān)的GO包括GO:0003824,GO:0016020,GO:0044425,GO:0009987和GO:0008152(對(duì)應(yīng)的基因?yàn)間ene07610,gene07894,gene08493,gene10012,gene10460,gene10511和gene10711)。基因(gene01275,gene04598,gene05822,gene06325,gene06631,Gene06756,gene07120,gene09398和gene09399)與α-葡萄糖苷酶的功能密切相關(guān)。gene00517,gene04336,gene04496,gene05720,gene06654,gene11604和gene11728與β-半乳糖苷酶有關(guān)。與β-1,4-木聚糖酶相關(guān)的基因包括基因01251,基因03061,基因04288,基因04893,基因05850和基因07094。

將4708種蛋白質(zhì)與KEGG途徑對(duì)應(yīng),46條途徑中12條代謝途徑(M),12條人類疾病途徑(HD),10條有機(jī)體系統(tǒng)途徑(OS),5條細(xì)胞過(guò)程途徑(CP),4條遺傳信息處理途徑(GIP)和3條環(huán)境信息處理途徑(EIP)顯著富集。碳水化合物代謝涉及134個(gè)基因,包括氨基糖和核苷酸糖代謝(ko00520,41個(gè)基因)、淀粉和蔗糖代謝(ko00500,29個(gè)基因)、丙酮酸鹽代謝(ko00620,16個(gè)基因,戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化(ko00040,15個(gè)基因)和果糖和甘露糖代謝(ko00051,12個(gè)基因)。在以前的研究中提到的ko00500與纖維素1,4-β-纖維素生物苷酶的降解和代謝有關(guān)。草酸青霉WX-209富含與纖維素酶和木聚糖酶相關(guān)的基因,對(duì)柑橘囊衣的降解具有良好的作用。通過(guò)全基因組測(cè)序和功能注釋,我們對(duì)酶的產(chǎn)生機(jī)制有了進(jìn)一步的理解。

2.7 碳水化合物活性酶(CAZy)鑒定

根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域中氨基酸序列的相似性,活性碳水化合物酶可分為六類:糖苷水解酶類(GHs),糖苷轉(zhuǎn)移酶類(GTs),多糖裂解酶類(PLs),碳水化合物酯酶類(CEs),碳水化合物結(jié)合模塊(CBMs)和輔助模塊酶類(AAs)。草酸青霉CAZymes蛋白質(zhì)編碼基因(PEG)的Blastp分析顯示,糖苷水解酶類是最主要的類別(GH,266個(gè)基因,44.93%),其次是35個(gè)糖基轉(zhuǎn)移酶(GT,125個(gè)基因,21.11%),11個(gè)碳水化合物酯酶(CE,115個(gè)基因,19.43%),13個(gè)輔助模塊酶(AA,57個(gè)基因,9.63%),13個(gè)碳水化合物結(jié)合模塊酶類(CBM,22個(gè)基因,3.72%)和6個(gè)多糖裂解酶(PL,7個(gè)基因,1.18%)參與碳水化合物代謝。

3 Conclusion

本研究以草酸青霉 WX-209為來(lái)源的粗酶液對(duì)柑橘囊衣的降解有較好的效果,其安全性在動(dòng)物水平上得到了驗(yàn)證。此外,對(duì)草酸青霉WX-209的基因組測(cè)序和分析揭示了其纖維素降解的相關(guān)基因與功能代謝。

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