通過流式細胞儀研究斑馬魚胚胎中細胞周期分析

[精華提要]結合綠色熒光蛋白表達的細胞周期分析廣泛的用于研究綠色熒光蛋白標記的細胞的細胞周期分布。這個方案是一種用綠色熒光蛋白標記的斑馬魚胚胎來分析細胞周期的方法。
材料與試劑
1.        PBS（Invitrogen公司14040）
2.        胎牛血清
3.        乙醇
4.        PFA（USB）
5.        Hoechst 33342 溶液（請加目錄編號）
6.        40 uM細胞過濾器（BD 352340）
7.        聚苯乙烯管流式細胞儀（BD尖底細心管352054）
8.        50ml尖底細心管中（BD 352070）
設備：
1.        流式細胞儀
2.        離心機
3.        水浴鍋
步驟
1.        準備流式細胞儀分析用的胚胎
1)      在37度水浴中解凍的胎牛血清。
2)      配制PBS + 5％FBS：9.5ml 0.9x PBS + 0.5ml FBS胎牛血清。
3)      把胚胎放置在一個5ml 的聚苯乙烯流式細胞管內（每次分析50個胚胎）。盡可能多吸收液體，并添加1ml PBS / FB。
4)      用最大速度1 / 4的速度混勻胚胎。請檢查沒有胚胎/細胞團塊。
5)      標記每個胚胎的1X 50ml 管。將40μm的細胞過濾器放到1套50ml 管。
6)      吸取胚胎的勻漿到過濾器。用1ml PBS / FB沖洗管和沖洗到過濾吸管。
7)      轉移篩選后的胚胎到5ml 的聚丙烯流式細胞儀管。
8)      在2000RPM離心5分鐘。
9)      吸取上清液。
如果不固定，重懸于500μl 的PBS / FB，放在冰上。
2.        甲醛固定細胞和乙醇固定/通透細胞
1)      用500μL冷0.9x PBS輕微重懸細胞。
2)      加入500μL冷的2％PFA（0.9xPBS）。輕輕混勻。
3)      冰上孵育30分鐘。 （確保70％的乙醇冷凍。）
4)      4 °C離心2000RPM，5分鐘。
5)      吸取上清（單獨收集PFA到廢物容器）和1ml 的冷0.9xPBS洗一次。
6)      4 °C 、 2000轉離心5分鐘。
7)      吸取上清。
Hoechst染色，直接按照Hoechst方案進行。
8)      慢慢加入1ml 70％乙醇，-20℃下細胞沉淀下降到管的底部。
9)      冰上孵育30分鐘。
10)  在孵化過程中，準備PI溶液（鋁箔！）
11)  4 °C離心2000轉，5分鐘。
12)  用500μLPI溶液重懸。
對于是固定的，沒有PI，在500μL 0.9xPBS重懸浮細胞
13)  在室溫暗箱中孵育30分鐘。
14)  過濾40μm至50ml 細胞管內。
15)  細胞轉移到5ml 的聚苯乙烯流式細胞儀管。
16)  置于冰上，然后進行流式細胞儀分析。
3.        Hoechst染色
1)      準備Hoechst 33342溶液，的1mg/ml儲存液 用0.9xPBS稀釋到1：1000。
2)      在28 ° C黑暗中孵育30分鐘。
3)      過濾40μm到50ml 管的細胞。
4)      將5ml 的聚苯乙烯流式細胞儀管的細胞。
5)      置于冰上，然后進行流式細胞儀分析。
配方
1.  PI溶液（鋁箔）：
PI + RNaseA在0.9xPBS
500ul 1mg/ml的PI儲存液（20x）
100ul 10mg/ml的核糖核酸酶A股（1ul/ml）
9.4mL 0.9x的PBS