MTT所有問題大匯總
實驗前應明確的問題
1. 選擇適當的細胞接種濃度。一般情況下，96 孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105 個細胞。但由于不同細胞貼壁后面積差異很大，因此，在進行MTT 試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以保證培養終止致細胞過滿。這樣，才能保證MTT 結晶形成酌量與細胞數呈的線性關系。否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。
2. 藥物濃度的設定。一定要多看文獻，參考別人的結果再定個比較大的范圍先初篩。根據自己初篩的結果縮小濃度和時間范圍再細篩。切記！否則，可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間。
3. 時間點的設定。在不同時間點的測定OD 值，輸入excel 表，最后得到不同時間點的抑制率變化情況，畫出變化的曲線，曲線什么時候變得平坦了（到了平臺期）那個時間點應該就是最好的時間點（因為這個時候的細胞增殖抑制表現的最明顯）。
4. 培養時間。200ul 的培養液對于10 的4~5 次方的增殖期細胞來說，很難維持68h ，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向G0 期而趨于靜止，影響結果，我們是在48h 換液的。
5. MTT 法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞絕對數。做MTT 時，盡量無菌操作，因為細菌也可以導致MTT 比色OD 值的升高。
6. 理論未必都是對的。要根據自己的實際情況調整。
7. 實驗時應設置調零孔，對照孔，加藥孔。調零孔加培養基、MTT 、二甲基亞砜。對照孔和加藥孔都要加細胞、培養液、MTT 、二甲基亞砜，不同的是對照孔加溶解藥物的介質，而加藥組加入不同濃度的藥物。
8. 避免血清干擾。用含15% 胎牛血清培養液培養細胞時，高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由于試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小于10% 胎牛血清的培養液進行。在呈色后，盡量吸凈培養孔內殘余培養液。
實驗步驟
貼壁細胞：
1. 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul ，鋪板使待測細胞調密度至1000-10000 孔，（邊緣孔用無菌PBS 填充）。
2. 5%CO2 ，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96 孔平底板），加入濃度梯度的藥物，原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥. 一般5-7 個梯度，每孔100ul ，設3-5 個復孔. 建議設5 個，否則難以反應真實情況
3. 5%CO2 ，37 ℃孵育16-48 小時，倒置顯微鏡下觀察。
4. 每孔加入20ulMTT 溶液（5mg/ml ，即0.5%MTT ），繼續培養4h 。若藥物與MTT 能夠反應，可先離心后棄去培養液，小心用PBS 沖2-3 遍后，再加入含MTT 的培養液。
5. 終止培養，小心吸去孔內培養液。
6. 每孔加入150ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min ，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490nm 處測量各孔的吸光值。
7. 同時設置調零孔（培養基、MTT 、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT 、二甲基亞砜）
懸浮細胞：
1. 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1 ×106/ml ，按次序將①補足的1640 （無血清）培養基40ul ；②加Actinomycin D （有毒性）10ul 用培養液稀釋 （儲存液100ug/ml ，需預試尋找最佳稀釋度，1 ：10-1 ：20 ）；③需檢測物10ul ；④細胞懸液50ul （即5 ×104cell/ 孔），共100ul 加入到96 孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ul 1640 ）。
2. 置37 ℃，5%CO2 孵育16-48 小時，倒置顯微鏡下觀察。
3. 每孔加入10 ul MTT 溶液（5 mg/ml ，即0.5%MTT ），繼續培養4 h 。（懸浮細胞推薦使用WST-1 ，培養4 h 后可跳過步驟4 ），直接酶聯免疫檢測儀OD570nm （630nm 校準）測量各孔的吸光值）
4. 離心（1000 轉x10min ），小心吸掉上清，每孔加入100 ul 二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min ，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD570nm （630nm 校準）測量各孔的吸光值。
5. 同時設置調零孔（培養基、MTT 、二甲基亞砜），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、MTT 、二甲基亞砜），每組設定3 復孔。
MTT的配制
MTT 一般最好現用現配，過濾后4oC 避光保存兩周內有效，或配制成5mg/ml 保存在-20 度長期保存，避免反復凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把MTT 粉分裝在EP 管里，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那么多，尤其當MTT 變為灰綠色時就絕對不能再用了。
MTT 有致癌性，用的時候小心，有條件最好帶那種透明的簿膜手套. 配成的MTT 需要無菌，MTT 對菌很敏感；往96 孔板加時不避光也沒有關系，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作臺上的照明燈關掉.
配制MTT 時用用PBS 溶解，也有人用生理鹽水配，60 ℃水浴助溶。
PBS 配方：
NaCl 8g
Kcl 0.2g
Na2 HPO4 1.44g
KH2 PO4 0.24g
調ph 7.4
定容1L
