原代軟骨細胞分離培養(yǎng)的總結(jié)

①一般根據(jù)實驗要求，選取不同年齡組的兔子，實際上兔子的年齡越小越好，畢竟幼體組織的活力要高于成體組織的活力，耳靜脈空氣注射法處死后,無菌條件下分離后肢關節(jié)軟骨和肋軟骨，剝離包裹軟骨組織的筋膜和軟骨膜，放入盛有PBS液的培養(yǎng)皿中。
②將分離得到的軟骨組織剁碎成0.3-0.5mm的組織塊，移入25cm2培養(yǎng)瓶，用含雙抗的PBS液沖洗軟骨3次。
③加入軟骨體積10-15倍的0.25%胰蛋白酶，37℃消化１－２小時后終止消化。
④加入0.02%II型膠原酶，37℃消化17-20小時（也就是過夜），這是我們實驗室長期摸索出來的方法，雖然比較浪費時間，但是獲得的細胞活力確實不錯。
⑤在倒置顯微鏡下觀察，當游離出單個細胞后，加入DMEM培養(yǎng)液將II型膠原酶稀釋終止消化。
⑥將細胞團吹打成單個細胞后用200目濾網(wǎng)過濾，收集濾液，1500r/min離心5min。
⑦棄上清，加入DS培養(yǎng)液重懸，0.2%臺盼藍染色，活細胞率大于90%，CO2培養(yǎng)箱孵育。