無血清培養(yǎng)基對體外激活的A-NK細(xì)胞的支持作用

基金項(xiàng)目:本課題受國家“九五”重點(diǎn)攻關(guān)課題（96-960A-01-20）和黑龍江省重點(diǎn)攻關(guān)課題（G00C190401）資助

【摘要】目的研究多方面比較無血清培養(yǎng)基AIMV與完全培養(yǎng)基對體外細(xì)胞因子激活的NK細(xì)胞的支持作用。方法分別用AIMV及完全培養(yǎng)基培養(yǎng)粘附NK細(xì)胞（A-NK）和非粘附NK細(xì)胞（NA-NK），比較細(xì)胞的增殖能力、殺傷腫瘤細(xì)胞的能力、表達(dá)粘附分子CD11 c 的能力，并通過電鏡對A-NK細(xì)胞所殺傷的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。結(jié)果與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞相比，AIMV培養(yǎng)細(xì)胞增殖能力、殺傷腫瘤細(xì)胞的能力、表達(dá)CD11 c 的能力與之相當(dāng);在同一培養(yǎng)條件下A-NK細(xì)胞的增殖能力、殺傷活性及表達(dá)CD11 c 的能力明顯強(qiáng)于NA-NK細(xì)胞;被A-NK細(xì)胞殺傷的腫瘤細(xì)胞死亡形式是溶解壞死和凋亡。結(jié)論無血清培養(yǎng)基可替代完全培養(yǎng)基用于A-NK細(xì)胞的培養(yǎng);A-NK細(xì)胞用于治療腫瘤的過繼免疫療法要優(yōu)于NA-NK細(xì)胞。

關(guān)鍵詞粘附NK細(xì)胞無血清培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng) 四甲基偶氮唑鹽比色法

The culturing of IL-2-activated natural killer cells were

suported with serum-free medium AIMV in vitro

Wang Zhihua，Zhang Yan，Zhang Chunyan

Cancer Research Institute，Harbin Medical University，Harbin150040.

【Abstract】 Objective To compare serum-free medium AIMV with standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro.Methods Proliferation，cytotoxicity in vitro and expression of CD11 c of the cells cultured in the two different media were compared.To observe the tumor target cells killed by adˉherent natural killer cells（A-NK）through electroscope.Results Cells cultured in serum-free medium AIMV could proliferate，kill target cellsand express CD11 c well enough to substitute the cells cultured in standard serum-containing medium.Proliferation，cytotoxicity and expression of CD11 c of A-NK were better than nonadherent natural killer cells（NA-NK）.Death patterns of tumor target cells were necrosis and apoptosis.Conclusion These data indiˉcate that serum-free medium AIMV could replace standard serum-containing medium in culturing IL-2-activated natural killer cells in vitro，and A-NK was the better cells than NA-NK in adoptive immunotherapy.

Key words adherent natural killer cell serum-free medium cell culture MTT-assay

NK細(xì)胞是表型和功能上的異質(zhì)性群體，根據(jù)在22nM（6000IU/ml）IL-2誘導(dǎo)下3～5h迅速粘附到塑料表面的能力，可將NK細(xì)胞分為兩種不同的亞群:粘附NK細(xì)胞（adˉherent natural killer cell，A-NK）和非粘附NK細(xì)胞（nonadherˉent natural killer cell，NA-NK）。A-NK細(xì)胞代表外周血淋巴細(xì)胞的一小部分（4%～30%），由于其體外增殖和抗腫瘤能力強(qiáng)，對正常細(xì)胞無殺傷作用等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來腫瘤過繼免疫療法的研究熱點(diǎn)。現(xiàn)在臨床上常用于細(xì)胞培養(yǎng)的完全培養(yǎng)基，因含有人AB血清，雖經(jīng)各種病毒的檢測，但仍有可能傳播其他疾病，而無血清培養(yǎng)基則可達(dá)到生物潔凈要求，克服了添加人AB血清的缺點(diǎn)，對于免疫治療的臨床推廣應(yīng)用有重要意義。本研究力求找到一種新的方法，發(fā)展無血清培養(yǎng)基用于A-NK細(xì)胞的臨床生物治療，即不減少A-NK細(xì)胞的數(shù)量和活性，又能增加其臨床應(yīng)用的安全性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 rhIL-2為南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所產(chǎn)品;淋巴細(xì)胞分離液、苯丙胺酸甲酯（PME）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）為Sigma公司產(chǎn)品;PE標(biāo)記的鼠抗人CD11 c 為美國Becton-Dickinson公司產(chǎn)品;RPMI1640培養(yǎng)液及無血清培養(yǎng)液AIMV為美國Gibco公司產(chǎn)品;人AB血清由哈爾濱市紅十字中心血站提供，用于人A-NK細(xì)胞培養(yǎng);胎牛血清為美國Hyclone公司產(chǎn)品，用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng);人肺腺癌細(xì)胞Anip973和人紅白血病細(xì)胞K562由本研究所建株傳代。所用塑料培養(yǎng)瓶和培養(yǎng)板均為美國Costar公司產(chǎn)品，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO 2 飽和濕化空氣的培養(yǎng)箱中建立培養(yǎng)。酶標(biāo)儀為BioRAU，450型，美國制造。

1.2 人外周血單個(gè)核細(xì)胞的制備淋巴細(xì)胞分離液常規(guī)分離健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞，充分洗滌后，置于塑料離心管中用PME（5mmol/L）室溫處理40min后充分洗滌備用。

1.3 A-NK細(xì)胞的誘導(dǎo) 用PME處理后的人外周血單個(gè)核細(xì)胞分別用完全培養(yǎng)基（RPMI1640，含10%人AB血清，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素）和無血清培養(yǎng)基AIMV在塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，每組加rhIL-2（6000IU/ml）并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×10 6 /ml。培養(yǎng)3～5h，移去含未粘附塑料表面的細(xì)胞懸液（即NA-NK細(xì)胞），收集粘附于塑料表面的細(xì)胞（即A-NK細(xì)胞），分別重懸于各自含50%自體條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)液中，調(diào)成細(xì)胞濃度為2×10 6 /ml，同時(shí)補(bǔ)充IL-2，細(xì)胞至終濃度為6000IU/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，每3天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液和IL-2，細(xì)胞濃度和IL-2終濃度不變［1］。

1.4 細(xì)胞增殖活性的測定采用改進(jìn)的四甲基偶氮唑鹽（MTT）比色法［2］。于培養(yǎng)的第1，4，7，10和第14天分別取細(xì)胞，充分洗滌，以1×10 6 /ml濃度加入96孔平底板中，每孔0.2ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，每孔加MTT（5mg/ml）20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后翻板，每孔滴加100μl二甲基亞砜（DMSO）輕輕振蕩10min后在酶標(biāo)儀上570nm處測定吸光度（OD值），取3孔均值，OD值高則增殖快。

1.5 細(xì)胞殺傷活性的測定采用MTT法進(jìn)行免疫活性細(xì)胞的細(xì)胞毒性測定。靶細(xì)胞為Anip973和K562腫瘤細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞為完全培養(yǎng)基和AIMV分別培養(yǎng)的A-NK細(xì)胞和NA-NK細(xì)胞，效靶比例為100:1。設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞共同孵育孔（E+T），效應(yīng)細(xì)胞對照孔（E）和靶細(xì)胞對照孔（T），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，操作方法同1.4。測定的OD值，取3孔均值，公式如下［2］ :細(xì)胞殺傷活性（%）=［1+（OD E+T -OD E ）/OD T ］×100

1.6 細(xì)胞表型分析細(xì)胞誘導(dǎo)3～5h后，分別收集完全培養(yǎng)基和AIMV培養(yǎng)的A-NK細(xì)胞和NA-NK細(xì)胞，按5×10 5 個(gè)細(xì)胞/管，用美國Becton-Dickinson公司的流式細(xì)胞儀檢測并分析CD11 c 的表達(dá)。

1.7 透射電鏡標(biāo)本制備在培養(yǎng)瓶中將A-NK細(xì)胞和K562腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，過夜，第二天取出離心（4000rpm×5min），用3%戊二醛固定30min（37℃）后按常規(guī)處理電鏡標(biāo)本。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞增殖能力的比較實(shí)驗(yàn)表明，除了第10天AIMV培養(yǎng)的A-NK細(xì)胞測得的OD值明顯低于完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的A-NK細(xì)胞外（P<0.01），其他時(shí)間AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞的增殖能力相當(dāng)，并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;AIMV和完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的A-NK細(xì)胞均大量增殖，OD值明顯高于同一培養(yǎng)條件下的NA-NK細(xì)胞;不同條件培養(yǎng)的細(xì)胞均在第7天達(dá)到增殖高峰，結(jié)果見表1。

2.2 AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞體外殺傷腫瘤細(xì)胞能力的比較 AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞體外殺傷腫瘤細(xì)胞的能力相當(dāng)，并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的A-NK細(xì)胞，其殺傷活性明顯高于NA-NK細(xì)胞;IL-2誘導(dǎo)的第7天是細(xì)胞殺傷活性的高峰期，結(jié)果見圖1。

表1 AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞OD值的比較

圖1 AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞殺傷活性的比較

2.3 AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)CD11 c 能力的比較AIMV與完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h后表達(dá)CD11 c 的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)相當(dāng);在同一培養(yǎng)條件下培養(yǎng)A-NK細(xì)胞表達(dá)CD11 c 的能力要高于NA-NK細(xì)胞。

2.4 透射電鏡結(jié)果透射電鏡下可見A-NK細(xì)胞在靶細(xì) 胞周圍形成花環(huán)，部分細(xì)胞變形，形成的突起或微絨毛伸向靶細(xì)胞，呈點(diǎn)狀或斑狀接觸。溶解壞死的腫瘤細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)漿網(wǎng)腫脹，線粒體內(nèi)外膜分離，胞質(zhì)中出現(xiàn)空泡變性，核染色質(zhì)破碎，核膜質(zhì)膜破裂，最終細(xì)胞崩解;凋亡的腫瘤細(xì)胞，可見核染色質(zhì)固縮、偏移，形成典型的致密月牙槽形聚集在核膜內(nèi)側(cè)面，基質(zhì)水腫變性，但核膜質(zhì)膜完整。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)在制備A-NK細(xì)胞的方法上力求簡便快速，利用NK細(xì)胞在22nM（6000IU/ml）IL-2誘導(dǎo)下，能在3～5h迅速粘附到塑料表面上的這一特性，將收集細(xì)胞的時(shí)間縮小到3～5h［1］。由于以往采用尼龍毛柱過濾，操作復(fù)雜而難以推廣應(yīng)用，我們采用PME（5mmol/L）室溫處理40min，以去除人外周血中某些抑制因素，如B細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞［3］。無血清培養(yǎng)基已經(jīng)得到越來越廣泛

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