核酸分子雜交的概念和基本原理

分子雜交的概念：

分子雜交（molecular hybridization）指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈（DNA或RNA），在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對原則經(jīng)過退火處理，形成異質(zhì)雙鏈的過程。

利用這一原理，就可以使用已知序列的單鏈核酸片段作為探針，去查找各種不同來源的基因組DNA分子中的同源基因或同源序列。

分子雜交基本原理：

一、DNA變性 ：

DNA變性是指雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開，形成單鏈無規(guī)則線團(tuán)，因而發(fā)生性質(zhì)改變（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等）。

1、DNA變性的方法：

① 加熱；

② 改變DNA溶液的pH；

③有機(jī)溶劑（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素。

2、增色效應(yīng)：DNA在260nm處有最大吸收值，這一特征是由于含有堿基的緣故。在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型中堿基藏于內(nèi)側(cè)，變性時由于雙螺旋解開，于是堿基外露，260nm紫外吸收值因而增加，這一現(xiàn)象稱為增色效應(yīng)（hyperchromic effect） 。利用DNA變性后波長260nm處紫外吸收的變化可追蹤變性過程。

3、溶解曲線：如果升高溫度使DNA變性，以溫度對紫外吸收作圖，可得到一條曲線，稱為溶解曲線。

4、融解溫度：通常人們把50%DNA分子發(fā)生變性的溫度稱為變性溫度（即熔解曲線中點(diǎn)對應(yīng)的溫度），由于這一現(xiàn)象和結(jié)晶的融解相類似，故又稱融點(diǎn)或融解溫度（melting temperature， Tm）。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半時的溫度。

5、影響Tm值的因素：Tm不是一個固定的數(shù)值，它與很多因素有關(guān)：

① pH、離子強(qiáng)度。隨著溶劑內(nèi)離子強(qiáng)度上升，Tm值也隨著增大。

② DNA的堿基比例、DNA的均一性 ；在相同條件下，DNA內(nèi)G-C配對含量高，其Tm值也高。

6、DNA中的GC含量與Tm值關(guān)系：

Tm = 69.3+ 0.41 × % （G C）

對于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4（G C） 2（A T）

實(shí)驗(yàn)表明DNA分子中（G C）克分子含量百分比的大小與Tm值的高低呈直線關(guān)系。

二、復(fù)性：

變性DNA只要消除變性條件，二條互補(bǔ)鏈還可以重新結(jié)合，恢復(fù)原來的雙螺旋結(jié)構(gòu)，這一過程稱為復(fù)性（renaturation） 。

退火：通常DNA熱變性后，將溫度緩慢冷卻，并維持在比Tm低25～30℃左右時，變性后的單鏈DNA即可恢復(fù)雙螺旋結(jié)構(gòu)，因此，這一過程又叫做退火。

復(fù)性后的DNA，理化性質(zhì)都能得到恢復(fù)。倘若DNA熱變后快速冷卻，則不能復(fù)性。

影響復(fù)性速度的因素：

1、DNA濃度：愈高，復(fù)性速度也愈快。

2、DNA片段的大?。篋NA片段愈大，擴(kuò)散速度愈低，使DNA片段線狀單鏈互相發(fā)現(xiàn)互補(bǔ)的機(jī)會減少。因此，在復(fù)性實(shí)驗(yàn)中，有時將DNA切成小片段，再進(jìn)行復(fù)性。

3、溫度：過高不利于復(fù)性。

4、溶液的離子強(qiáng)度：通常鹽濃度較高時，復(fù)性速度較快。

5、DNA順序的復(fù)雜性；簡單的分子復(fù)性很快，如polyd[T]和polyd[A]由于彼此互補(bǔ)識別很快，故能迅速復(fù)性。但順序較復(fù)雜的DNA分子復(fù)性則較慢。因此通過變性速率的研究，可以了解DNA順序的復(fù)雜性。