Trizol 法提取RNA實驗步驟

Trizol 法提取RNA實驗步驟
需要的試劑：
氯仿
異丙醇
75%乙醇（in DEPC-treated water)
RNase free水或者0.5% SDS溶液 [準備不含RNase的水，將其裝入不含RNase的玻璃瓶中，加入diethylpyrocarbonate (DEPC) to 0.01% (v/v)。靜置過夜，然后高壓滅菌。0.5% SDS溶液必須用DEPC預(yù)處理、高壓滅菌的水]
1、組織勻漿
(1)  取出高溫高壓消毒后研缽，切取50-100mg冰凍組織置于研缽內(nèi)，倒入液氮，研碎。
(2)  每50-100mg均漿組織標本中加入1ml的TRIZOL，標本的量不能超過TRIZOL體積的10%，否則會出現(xiàn)DNA污染。
(3)  將以上勻漿標本轉(zhuǎn)移到1.5ml的EP管中，在15- 30°C放置5分鐘，以徹底分離核蛋白復(fù)合體。
2、相分離
加入0.2 ml的氯仿，加蓋好后用手劇烈搖晃15秒，在15- 30°C放置2-3分鐘，然后離心 12,000× g，15 minutes ， 2 - 8°C。離心后分成三層，下面的紅色為酚-氯仿相，一個中間層，一面是無色的水相。RNA只存在于水相中。水相占總TRIZOL的60%。
3、RNA沉淀
將上層水相轉(zhuǎn)移到另一干凈的EP管中， 加入0.5ml異丙醇，靜置10 minutes ，15 -30°C，然后離心12,000 × g ，10 minutes， 2 - 8°C。離心前可以在管的側(cè)壁和底部看到絮狀膠樣沉淀，這就是RNA沉淀。
4、RNA洗滌
去上清， 加入1ml 75%乙醇洗滌RNA沉淀，振蕩器混勻，離心7,500 × g ，5 minutes，2 -8°C。
5、RNA再溶解
去上清，置真空或空氣中5-10分鐘，干燥RNA沉淀，（不能在真空中離心干燥）。注意不能將RNA沉淀完全干燥，這樣會極大地降低它的溶解度。部份溶解的RNA樣品其A260/280 ratio < 1.6。
用無RNase 水或0.5% SDS溶液重懸RNA沉淀，用槍頭反復(fù)吹打幾次，靜置10分鐘，55-60°C。測濃度后-20°C保存。
6、測濃度： 取2μl 儲存液加入另一個EP管中，再加入98μl無RNase水，離心混勻，以無RNase水作空白對照，測OD260/280值。1 OD=40μg RNA。OD260/280值在1.8-2.0視為純度很高。一般濃在1000ng/ml較準。濃度太高要稀釋以后再測定。
7、RNA鑒定：甲醛變性瓊脂糖電泳，確定抽提RNA完整性和DNA污染情況。
注意事項:
在使用TRIZOL的時候要帶手套和眼罩，避免接觸到皮膚和衣服，使用化學通風櫥，防止蒸汽吸入。
除非特別說明，所有的操作均在15-30°C下進行，所用的試劑均放置于15-30°C。
組織在加入氯仿之前是可以在-60—-70°C放置一個月 。RNA沉淀在75%乙醇中在2-8°C下至少可以放置一周，在–5— -20°C至少可能放置一年。