RNA提取的一般步驟:各種方法的匯總

RNA提取原理： 通過變性劑破碎細胞或者組織，然后經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。所有RNA的提取過程中都有五個關鍵點，即：樣品細胞或組織的有效破碎；有效地使核蛋白復合體變性；對內源RNA酶的有效抑制；有效地將RNA從DNA和蛋白混合物中分離；對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質的有效除去。但其中最關鍵的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA的提取目前階段主要可采用兩種途徑:提取總核酸，再用氯化鋰將RNA沉淀出來；直接在酸性條件下抽提，酸性下DNA與蛋白質進入有機相而RNA留在水相。第一種提取方法將導致小分子量RNA的丟失，目前該方法的使用頻率已很低實驗步驟：破碎組織→分離RNA→沉淀RNA→洗滌RNA→融解RNA→保存RNA。1、破碎織和滅活RNA酶可以同步進行，可以用鹽酸胍、硫氰酸胍、NP-40、SDS、蛋白酶K等破碎組織，加入β-ME可以抑制RNA酶活性。
2、分離RNA一般用酚、氯仿等有機溶劑，加入少量異戊醇，經過此步，離心，RNA一般分布于上層，與蛋白層分開。
3、沉淀RNA一般用乙醇、3M NaAc（pH-5.2）或異丙醇
4、洗滌RNA使用70％乙醇洗滌，有時，為避免RNA被洗掉，此步可以省掉，洗滌之后可以晾干或者烤干乙醇，但是不能過于干燥，否則不易溶解。
5、融解RNA一般使用TE。
6、保存RNA應該盡量低溫。為了防止痕量RNase的污染，從富含RNase的樣品（如胰臟、肝臟）中分離到的RNA需要貯存在甲醛中以保存高質量的RNA，對于長期貯存更是如此。從大鼠肝臟中提取的RNA，在水中貯存一個星期就基本降解了，而從大鼠脾臟中提取的RNA，在水中保存3年仍保持穩定。另外，長度大于4kb的轉錄本對于痕量RNase的降解比小轉錄本更敏感。為了增加貯存RNA樣品的穩定性，可以將RNA溶解在去離子的甲酰胺中，存于-70℃。用于保存RNA的甲酰胺一定不能含有降解RNA的雜物。來源于胰臟的RNA至少可以在甲酰胺中保存一年。當準備使用RNA時，可以使用下列方法沉淀RNA：加入NaAc至0.3M，12,000×g離心5分鐘。氯化鋰法提取總RNA：本方法用高濃度尿素變性蛋白并抑制RNA酶，用氯化鋰選擇沉淀RNA，其特別適合于從大量樣品中提取少量組織RNA，具有快速簡潔的長處，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高,小RNA片斷丟失的缺陷。試驗試劑：1.氯化鋰/尿素溶液【氯化鋰126g(3M) 尿素、360g(6M) 加水至1L，過濾滅菌】2.懸浮液【10mM Tris-HCL (pH7.6) ,1mM EDTA (pH8,0) ,0.5%SDS】試驗步驟：
1、 對于大量組織或細胞，則每克組織或細胞加入5－10ml氯化鋰－尿素溶液，勻漿器高速勻漿2分鐘；對于少量細胞（107個細胞/ml），則每克組織或細胞加入0.5ml氯化鋰－尿素溶液手工勻漿，并轉移至Eppendof管中。
2、勻漿液在0－4℃放置4小時后，12000g離心30分鐘。
3、取沉淀，加入原勻漿液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液，重復步驟2。
4、沉淀用原勻漿液1/2體積的氯化鋰－尿素溶液復溶后，加入等體積酚/氯仿/異戊醇在室溫放置15－30分鐘并不時搖動混勻，4000g離心5分鐘。
5、取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心。
6、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
7、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。蛋白酶－熱酚法*
本方法適合于病毒RNA的提取
試驗試劑：
1、蛋白酶K（終濃度50ug/ml）
2、2×緩沖液：1%SDS 20mMTris-HCL (pH 7.6) 0.2M NaCL+
試驗步驟：
1、提純病毒液中加入等體積緩沖液、蛋白酶K,37℃40-50分鐘。
2、加入等體積65℃預熱的酚溶液，輕徭,在65℃保溫5分鐘后再輕徭。
3、離心，取上清，氯仿抽提一次。
4、取上層水相，加1/10倍體積的3M乙酸鈉（pH5.2）及2倍體積的乙醇，－20℃放置1小時，5000g離心(10000g,10min)。
5、70％乙醇洗沉淀一次。真空干燥。
6、RNA溶解液溶解沉淀，得RNA，分裝，于－70℃保存。RNA提取一般步驟總結