RNAi表達載體構建
近年來的研究表明,一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型, 稱為RNA干擾（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子,能夠以序列同源互補的mRNA為靶目標,降解特定的mRNA.RNAi的發現具有劃時代的意義,它不僅深入揭示 了細胞內基因沉默的機制,而且它還是后基因組時代基因功能分析的有力工具,極大地促進了人類揭示生命奧秘的進程.現在越來越多的研究人員開始采用RNAi 來研究生物體的基因表達.RNAi技術可廣泛應用到包括功能基因組學,藥物靶點篩選,細胞信號傳導通路分析,疾病治療等等.
目前為止較為常用的5種制備siRNAs的方法包括：
·化學合成
·體外轉錄
·長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)
·siRNA表達載體或者病毒載體在細胞中表達siRNAs
·PCR制備的siRNA表達框在細胞中表達
獲得高純度的siRNA產物是進行實驗的第一步,而轉染的效率則是非常關鍵的因素.
一、基本概念
RNAi：（RNA interference）RNA干擾
內源性或外源性雙鏈RNA(dsRNA)介導的能誘導細胞內與其序列同源的特異基因表達沉默或抑制的效應,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型,稱為RNA干擾,它也是體內抵御外在感染的一種重要保護機制.
siRNA ：(small interfering RNAs)小干擾RNA
由長dsRNA裂解而成的一種19-25nt的短片斷雙鏈RNA分子,能夠以同源互補序列的RNA為靶目標降解特定的mRNA, RNAi的關鍵效應分子.
shRNAs:(small hairpin RNA )小發夾RNA
是設計為能夠形成發夾結構的非編碼小RNA分子,shRNA需通過載體導入細胞后,然后利用細胞內的酶切機制得到siRNA而最終發揮RNA干擾作用.
Dicer：屬于RNaseⅢ 家族,是dsRNA的特異性核酸內切酶
RISC：(RNA-inducing silencing complex) RNA誘導的沉默復合體,具有核酸內切、外切以及解旋酶活性
二、機制
目前普遍認為,共抑制、基因壓制和RNAi很可能具有相同的分子機制,都是通過dsRNA的介導而特異地降解靶mRNA, 抑制相應基因的表達. 即RNAi、共抑制、quelling均屬于PTGS！現已初步闡明dsRNA介導的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步.
第一步（起始階段）是較長ds RNA在ATP參與下被RNaseⅢ樣的特異核酸酶切割加工成21~23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）.
第二步（效應階段）是siRNA 在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈,并由其中反義鏈指導形成RNA誘導的沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC).
RNAi途徑主要存在于細胞漿中,但是siRNA產生、靶mRNA降解的亞細胞位置尚未明確.外源性（注射或喂養）的dsRNA和病毒性dsRNA可能可以直接進入細胞漿中的RNAi途徑,僅在細胞漿中復制的RNA病毒可被dsRNA介導的沉默機制所抑制.外源性dsRNA則還可導致細胞核中的同源早期 RNA轉錄產物減少.
在許多機體中反向重復轉基因序列在細胞核內轉錄成發夾dsRNA,進而可介導RNAi,這種dsRNA可能需要轉移至胞漿中才可有效地沉默同源靶mRNA.
RNAi的放大效應機制
siRNA不僅可引導RISC切割靶RNA,而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶(RdRP)作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA
新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNaseⅢ樣核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNA.次級siRNA又可進入合成-切割的循環過程,進一步放大RNAi作用.這種合成-切割的循環過程稱為隨機降解性PCR（random degradative PCR）.
三、RNAi表達載體的構建
1. 目的基因的確定
（1）、檢索文獻獲取有實驗證明有效的靶點序列（核對）
（2）、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
（3）、http://www.google.cn/ or http://scholar.google.com
2、設計siRNA靶序列
在制備siRNA 前都需要單獨設計siRNA序列.研究發現對哺乳動物細胞,最有效的siRNAs是21-23個堿基大小、3’端有兩個突出堿基的雙鏈RNA；而對非哺乳動物,比較有效的是長片段dsRNA.siRNA的序列專一性要求非常嚴謹,與靶mRNA之間一個堿基錯配都會顯著削弱基因沉默的效果.
（1）、選擇siRNA靶位點：
從轉錄AUG起始密碼子開始,搜尋下游AA序列,記錄跟每個AA 3’端相鄰的19個核苷酸作為候選的siRNA靶位點.有研究結果顯示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更為有效. Tuschl等建議在設計siRNA時不要針對5'和3'端的非編碼區（untranslated regions,UTRs),原因是這些地方有豐富的調控蛋白結合區域,而這些UTR結合蛋白或者翻譯起始復合物可能會影響siRNP核酸內切酶復合物結 合mRNA從而影響siRNA的效果.
（2）、序列同源性分析:
將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人,或者小鼠,大鼠等等）進行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列.例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標序列進行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚,可能是位置效應的結果,因此對于一個目的基因,一般要選擇3-5個靶位點來設計siRNA.
通常來說,每個目標序列設計3—4對siRNAs,選擇最有效的進行后續研究.
（3）、設計陰性對照：
一個完整的siRNA實驗應該有陰性對照,作為陰性對照的siRNA應該和選中的siRNA序列有相同的組成,但是和mRNA沒有明顯的同源性.通常的做法是將選中的siRNA中的堿基序列打亂.當然,同樣要保證它和其他基因沒有同源性.
3、RNAi表達載體的選用
化學合成與體外轉錄方法都是在體外得到siRNA后再導入細胞內,但是這兩種方法主要有兩方面無法克服的缺點：siRNA進入細胞后容易被降解；進入細胞siRNA在細胞內的 RNAi效應持續時間短.針對這種情況,出現了質粒、病毒類載體介導的siRNA體內表達.該方法的基本思路是：將siRNA對應的DNA雙鏈模板序列克隆入載體的RNA聚合酶III的啟動子后,這樣就能在體內表達所需的siRNA分子.這種方法總體的優點在于不需要直接操作RNA,能達到較長時間的基因沉默效果.
通過質粒表達siRNAs大都是用Pol III啟動子啟動編碼shRNA(small hairpin RNA)的序列.選用Pol III啟動子的原因在于這個啟動子總是在離啟動子一個固定距離的位置開始轉錄合成RNA,遇到4—5個連續的U即終止,非常精確.當這種帶有Pol III 啟動子和shRNA模板序列的質粒轉染哺乳動物細胞時,這種能表達siRNA的質粒確實能夠下調特定基因的表達,可抑制外源基因和內源基因.采用質粒的優點在于,通過siRNA表達質粒的選擇標記,siRNA載體能夠更長時間地抑制目的基因表達.當然還有一點,那就是由于質粒可以復制擴增,相比起其它合成方法來說,這就能夠顯著降低制備siRNA的成本.
此外,帶有抗生素標記的siRNA表達載體可用于長期抑制研究,通過抗性輔助篩選,該質粒可以在細胞中持續抑制靶基因的表達數星期甚至更久.同時RNAi-Ready表達載體還能與逆轉錄病毒和腺病毒表達系統整合（BD Knockout RNAi Systems）,大大提高siRNA表達載體對宿主細胞的侵染性,徹底克服某些細胞轉染效率低的障礙,是實現哺乳動物細胞siRNAs瞬時表達與穩定表 達的理想工具.
4、合成模板
合成編碼 shRNA的DNA 模板的兩條單鏈,模板鏈后面接有RNA PolyIII聚合酶轉錄中止位點,同時兩端分別設計 BamH I 和 Hind III 酶切位點,可以克隆到 siRNA 載體多克隆位點的 BamH I 和 Hind III 酶切位點之間.
95℃,5min,緩慢退火, DNA 單鏈得到 shRNA 的 DNA 雙鏈模板
5、連接與轉化
基本步驟：
（1）將100μl感受態細胞于冰上解凍.
（2）取5μl連接產物加入到感受態細胞中,輕輕旋轉幾次以 混勻內容物. 在冰上放置30分鐘.
（3）將管放入預加溫到42℃的水浴中,熱激90秒.快速將管轉移到冰浴中,使細胞冷卻1~2分鐘.
（4）每管中加700μl LB培養基,37℃振蕩培養1小時,進行復蘇.
（5）室溫4,000rpm離心5分鐘,棄去上清后,用剩余100μl培養基重懸細胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面.注意：細胞用量應根據連接效率和感受態細胞的效率進行調整.
（6）將平板置于室溫直至液體被吸收.
（7）倒置平皿,于37℃培養,12~16小時后可出現菌落.
6、PCR鑒定和測序鑒定
在插入編碼shRNA的DNA雙鏈模板兩側設計鑒定PCR引物,擴增片段在100-200bp之間.
7、特點
siRNA表達載體的優點在于這是眾多方法中唯一可以進行長期研究的方法——帶有抗生素標記的載體可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久.即使是對轉染帶有篩選標記質粒的細胞進行瞬時篩選,也有助于富集帶質粒的細胞.這也可以幫助解決一些難轉染的細胞由于轉染效率低造成的問題.
載體上的抗性標記有助于快速篩選出陽性克隆,而且可以在細胞中持續抑制靶基因的表達,持續數星期甚至更久,可以進行較長期研究 .
四、RNAi的前景展望
1、研究基因功能的新工具
已有研究表明RNAi能夠在哺乳動物中滅活或降低特異性基因的表達,制作多種表型,而且抑制基因表達的時間可以隨意控制在發育的任何階段,產生類似基因敲除的效應.線蟲和果蠅的全部基因組序列已測試完畢,發現大量未知功能的新基因,RNAi將大大促進對這些新基因功能的研究.與傳統的基因敲除技術相比,這一技術具有投入少,周期短,操作簡單等優勢,近來RNAi成功用于構建轉基因動物模型的報道日益增多,標志著RNAi將成為研究基因功能不可或缺的工具.
2、研究信號傳導通路的新途徑
聯合利用傳統的缺失突變技術和RNAi技術可以很容易地確定復雜的信號傳導途徑中不同基因的上下游關系,Clemensy等應用RNAi研究了果蠅細胞系中胰島素信息傳導途徑,取得了與已知胰島素信息傳導通路完全一致的結果,在此基礎上分析了DSH3PX1與DACK之間的關系, 證實了DACK是位于DSH3PX1磷酸化的上游激酶. RNAi技術較傳統的轉染實驗簡單、快速、重復性好,克服了轉
染實驗中重組蛋白特異性聚集和轉染效率不高的缺點, 因此認為RNAi技術將可能成為研究細胞信號傳導通路的新途徑.
3、開展基因治療的新策略
RNAi具有抵抗病毒入侵,抑制轉座子活動,防止自私基因序列過量增殖等作用,因此可以利用RNAi現象產生抗病毒的植物和動物,并可利用不同病毒轉錄序列中高度同源區段相應的dsRNA抵抗多種病毒.
腫瘤是多個基因相互作用的基因網絡調控的結果,傳統技術誘發的單一癌基因的阻斷不可能完全抑制或逆轉腫瘤的生長, 而RNAi可以利用同一基因家族的多個基因具有一段同源性很高的保守序列這一特性, 設計針對這一區段序列的dsRNA分子,只注射一種dsRNA即可以產生多個基因同時剔除的表現,也可以同時注射多種dsRNA而將多個序列不相關的基因同時剔除.
盡管目前RNAi技術在哺乳動物中的應用還處于探索階段,但它在斑馬魚和老鼠等脊椎動物中的成功應用預示著RNAi將成為基因治療中重要的組成部分,人工合成的dsRNA寡聚藥物的開發將可能成為極具發展前途的新興產業.
