酵母RNA的提取

一、目的：

學(xué)習(xí)稀堿法提RNA的原理與技術(shù)。

二、原理：

由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實驗室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出，此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)。上述方法提取的RNA具有生物活性。工業(yè)上常用稀堿法和濃鹽法提取RNA，用這2種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備核苷酸的原料，其工藝比較簡單。濃鹽法是用10%左右氯化鈉溶液，90℃提取3―4h，迅速冷卻，提取液經(jīng)離心后，上清液用乙醇沉淀RNA。

稀堿法使用稀堿（本實驗用0.2%NaOH溶液）使酵母細(xì)胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA（本實驗）或調(diào)pH2.5利用等電點沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。

酵母含RNA達(dá)2.67―10.0%，而DNA含量僅為0.03―0.516%，為此，提取RNA多以酵母為原料。

三、器材與試劑：

1．器材：

①干酵母粉（市售）。

②鮮酵母（市售）。

③pH試紙（pH1―10）。

④臺天平（100g）。

⑤燒杯100ml（×1）。

⑥量筒50ml（×1）、10ml（×1）。

⑦抽濾瓶500ml（×1）、布氏漏斗φ10cm（×1）。

⑧吸管0.5ml（×1）、1ml（×2）、2ml（×2）、5ml（×1）。

⑨離心機5000r?min-1。

2．試劑：

①0.2%氫氧化鈉溶液：2gNaOH溶于蒸餾水并稀釋至1000ml。

②乙酸（A?R）。

③95%乙醇。

④無水乙醚（C?P）。

⑤氨水（C?P）。

⑥10%硫酸溶液：濃硫酸（比重1.84）10ml，緩緩 傾于水中，稀釋至100ml。

⑦5%硝酸銀溶液：5gAgNO3 溶于蒸餾水并稀釋至100ml，貯于棕色瓶中。

⑧苔黑酚―三氯化鐵試劑：將100mg苔黑酚溶于100ml濃鹽酸中，再加入100mgFeCl3 ?6H2 O。臨用時配制。

四、操作步驟：

1．RNA的提取：置4g干酵母粉于100ml燒杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加熱30分鐘，經(jīng)常攪拌。加入乙酸數(shù)滴，使提取液呈酸性（石蕊試紙），離心10―15分鐘（4000r?min-1）。取上清液，加入95%乙醇30ml，邊加邊攪。加畢，靜置，待完全沉淀，過濾。濾渣先用95%乙醇洗2次（每次約10ml），繼用無水乙醚洗2次（每次10ml），洗滌時可用細(xì)玻棒小心攪動沉淀。乙醚濾干后，濾渣即為粗RNA，可作鑒定。

2．鑒定：取上述RNA約0.5g，加10%硫酸液5ml，加熱至沸1―2分鐘，將RNA水解。

（1）取水解液0.5ml，加苔黑酚―FeCl3試劑1ml，加熱至沸1分鐘，觀察顏色變化。

（2）水解液2ml，加氨水2ml及5%硝酸銀溶液1ml，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌呤銀化合物（有時絮狀物出現(xiàn)較慢，可放置十幾分鐘）。