cDNA的制備與檢測
[實驗原理]
總RNA,經(jīng)寡聚(d丁)纖維素親和層析柱分離出mRNA,以寡聚(d丁)為引物,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成雙鏈cDNA。先用反轉(zhuǎn)錄酶合成第一條cDNA鏈;經(jīng)堿降解作用除去RNA模板后用大腸桿菌DNA聚合酶,以第一條鏈cDNA的3’末端結構為引物合成第二鏈,最后形成雙鏈cDNA。
[儀器、材料與試劑]
(一)儀器和材料
紫外線透射儀、移液槍、瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)
(二)試劑
特異引物、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒
[實驗步驟]
(一)cDNA的合成
1、取約9uL mRNA,依次加入:第一鏈緩沖液4uL,RNA酶抑制劑1 uL,Oligo(dT)引物2uL,dNTP混合液2uL AMV逆轉(zhuǎn)錄酶2uL,混勻,離心10min,42℃水浴1h。
2、在冰上于第一鏈反應產(chǎn)物中,加入以下試劑:第二鏈緩沖液然40uL,RNA酶H 1uL,大腸桿菌DNA聚合酶5uL,DEPC處理過的水至100uL,混勻,離心10s,12℃、22℃、65℃水浴各1h。
3、加入T4DNA聚合酶,振蕩混勻后離心10s,37℃水浴10min。
4、加入10uL 200mmol/L EDTA和2ul SDS(10%,W/V)
5、加入80uLTE,20uL 3mol/L醋酸鈉,400uL乙醇,-20℃放置15min。
6、15000rpm 離心15min。
7、棄上清,稍晾干至無乙醇味,加40uLTE溶解沉淀,即為合成的cDNA。
(二)cDNA電泳檢測
取約5ul反應產(chǎn)物,在1%瓊脂糖凝膠上電泳,EB染色,紫外燈下檢測,呈現(xiàn)出大小在200—10Kb的拖帶,其中重心區(qū)域小1—4Kb之間,這說明反轉(zhuǎn)錄完全,得到了高質(zhì)量的cDNA。