藍(lán)白斑篩選假陰性

質(zhì)粒除有抗性基因外，往往還帶有其他明顯的篩選標(biāo)記，最常用的是藍(lán)白斑篩選（ -半乳糖苷酶系統(tǒng)）。此類載體攜帶lacZ’基因，它編碼β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且處于可被安慰誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，與乳糖結(jié)構(gòu)類似但不能被β-半乳糖苷酶降解）誘導(dǎo)的啟動(dòng)子調(diào)控之下。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌為LacZ△M15 基因型（含有編碼N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。

未重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后，在IPTG 的誘導(dǎo)下，質(zhì)粒與基因組分別表達(dá)缺陷但可以相互補(bǔ)償?shù)膬蓚€(gè)肽（即α-互補(bǔ)），形成了有功能的β-半乳糖苷酶，該酶能把培養(yǎng)基中無色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深藍(lán)色的5-溴-4-氯-靛藍(lán)。

然而當(dāng)外源DNA 插入質(zhì)粒位于α-肽編碼序列中的多克隆位點(diǎn)時(shí)，由于破壞了α-肽的閱讀框架，因而不能表達(dá)出與宿主菌基因組表達(dá)的缺陷型β-半乳糖苷酶多肽發(fā)生α-互補(bǔ)。由于沒有β-半乳糖苷酶的酶解作用，致使重組菌形成白色菌落。由此，可以借助藍(lán)白斑很容易篩選出重組子.
不過實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)當(dāng)插入小片段時(shí)，重組子也有形成淺藍(lán)斑的情況.即藍(lán)色菌斑也有可能含外源基因。據(jù)最新報(bào)道，大概有30%的假陰性.

盡管藍(lán)白斑篩選應(yīng)用了二十余年，但假陽性和假陰性卻經(jīng)常出現(xiàn)，促使人們不斷對分子克隆方法提出改進(jìn)，并思考著建立新的載體和克隆技術(shù)。

但迄今為止，幾乎沒有一個(gè)克隆系統(tǒng)可以保[ ]證不會(huì)出現(xiàn)假陽性克隆。Slilaty SN和 Lebel S.研究證明，藍(lán)白斑篩選的載體，通常將插入位點(diǎn)放在LacZ 基因的起始密碼子ATG到第 7 個(gè)氨基酸密碼子之間。

但如果將插入位置改變到LacZ基因的第 11-36 個(gè)氨基酸密碼子之間，那么就可以完全消除假陽性和假陰性。Genomics One公司正是利用了他們的研究結(jié)果開發(fā)出TrueBlue技術(shù)，同樣是藍(lán)白斑篩選，但準(zhǔn)確率可達(dá) 100%。