肝臟細(xì)胞RNA的提取
一．原理
RNA提取技術(shù)不僅是分子生物學(xué)技術(shù)的重要組成部分，也是功能基因組 學(xué)科研技術(shù)的重要基礎(chǔ)。從RNA水平研究生物體內(nèi)基因的調(diào)控機(jī)制，已成為分子生物學(xué)研究的一個重要手段。對某一生物或組織進(jìn)行性狀研究，首先要獲得該性狀基因，從組織細(xì)胞中分離完整的RNA對于分子克隆 和基因表達(dá)分析等實(shí)驗是至關(guān)重要的，如Northern印跡及雜交分析、cDNA合成等實(shí)驗的成效在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。利用提取的RNA人們可以對特定的基因表達(dá)進(jìn)行定量的檢測，從分子水平精確的了解細(xì)胞生命活動的規(guī)律。通常一個典型的哺乳動物細(xì)胞約含有10-5μgRNA ，其中80%～85%為rRNA（主要是28S、18 S和5.8 S、5S四種類型）；10%～15%為tRNA和核內(nèi)小分子RNA。
這些高峰度的RNA的大小和序列確定，可通過凝膠電泳、密度梯度離心、陰離子交換層析和高壓液相層析（HPLC）分離。相反，占RNA總量1%～5%的為mRNA 。mRNA 雖然大小和核苷酸序列各不相同，從數(shù)百至數(shù)千堿基不等，但大多數(shù)真核細(xì)胞mRNA在其3'端均有一寡聚腺苷酸(polyA)組成的尾，其長度一般足以吸附于寡聚脫氧胸苷酸―纖維素[oligo(dT)] ，使得mRNA可以利用親和層析法分離。
這個群體編碼了所有由該細(xì)胞合成的多肽。研究表明RNA極不穩(wěn)定，易于降解，而RNA酶幾乎無處不在，且特別穩(wěn)定，故在提取RNA時關(guān)鍵因素是最大程度的避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力，因此，創(chuàng)造一個無RNA酶的環(huán)境，嚴(yán)格防止RNA酶污染是成功提取RNA的關(guān)鍵。
對內(nèi)源性RNA酶，主要運(yùn)用RNA酶抑制劑，目前常用的RNA酶抑制劑有：
①RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑(RNasin)，它是從人胎盤分離的一種蛋白質(zhì)，可以與多種RNA酶緊密結(jié)合形成非共價結(jié)合的復(fù)合物，使RNA酶失活。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑制品經(jīng)數(shù)次凍融后或放在氧化條件下應(yīng)棄之不用。RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑不干擾反轉(zhuǎn)錄或mRNA在無細(xì)胞體系中的翻譯；
②氧釩核糖核苷復(fù)合物，它是由氧釩離子和4種核糖核苷之中的任意一種所形成的復(fù)合物，是一種過渡態(tài)似物，它能與多種RNA酶結(jié)合并高效抑制RNA酶活性。然而氧釩核糖核苷復(fù)合物能強(qiáng)烈抑制mRNA在無細(xì)胞體系中的翻譯，因此必須用含0.1%羥基喹啉的苯酚多次抽提以除之；
③硅藻土，硅藻土能吸附RNA酶，并且在后續(xù)的RNA純化過程中經(jīng)離心除去；
④異硫氰酸胍，它是強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，在破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從細(xì)胞核中解離出來的同時也使RNA酶變性失活；
⑤焦碳酸二乙酯(DEPC)，它是RNA酶強(qiáng)烈抑制劑，但其作用并不是絕對的。DEPC主要用于不能高壓滅菌的材料和器皿的RNA酶處理；
⑥其它化學(xué)試劑，如SDS、尿素等對RNA 酶也有一定的抑制作用。
對外源性RNA酶主要通過以下幾個途徑污染RNA制品：
①玻璃制品、塑料制品和電泳槽；
②研究人員造成的污染；
③污染的溶液。
因此在實(shí)驗中必須采取下列措施抑制外源性RNA酶：
①實(shí)驗室用的普通玻璃制品和塑料制品經(jīng)常有RNA酶污染，使用前必須于180℃干烤3h以上(玻璃制品)或用氯仿沖洗(塑料制品)。另一種方法是用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡玻璃制品和其它用品2h，然后用滅菌水淋洗數(shù)次，并于100℃干烤15min。RNA電泳槽需用去污劑洗滌，用水沖洗，乙醇干燥，再浸泡于3%H2O2溶液10min，然后用0.1%DEPC水徹底沖洗電泳槽。滅菌的一次性使用的塑料制品基本上無RNA酶，可以不需要處理；
②在RNA提取過程中,應(yīng)戴一次性手套,對接觸可能污染的器皿時，應(yīng)勤換手套；
③配制的溶液應(yīng)盡可能用0.1%DEPC水在37℃處理12h以上，然后高壓滅菌除去殘留的DEPC。對不能高壓滅菌的試劑，用經(jīng)DEPC水配制處理過的無菌蒸餾水配制，然后用0.22μm濾膜過濾除菌。
真核細(xì)胞總RNA 制備方法有多種，包括異硫氰酸胍—氯化銫超速離心法、鹽酸胍—有機(jī)溶劑法、氯化鋰—尿素法以及熱酚法、異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法以及TRIzol試劑提取法等。目前實(shí)驗室提取總RNA的常用方法為異硫氰酸胍法—酚—氯仿一步法和TRIzol試劑提取法。異硫氰酸胍法制備真核細(xì)胞總RNA，是將已知最強(qiáng)的RNase酶抑制劑異硫氰酸胍、β-巰基乙醇和去污劑N-十二烷基肌氨酸鈉聯(lián)合使用，抑制了RNA的降解，增強(qiáng)了核蛋白復(fù)合物的解離，使RNA和蛋白質(zhì)分離并進(jìn)入溶液，RNA選擇性地進(jìn)入無DNA和蛋白質(zhì)的水相，容易被異丙醇沉淀濃縮。
