Trizol改良方法總結(jié)

① 200mg新鮮葉組織置于預(yù)冷研缽中，+聚乙烯吡咯烷酮粉(PVP)，液氮中研磨成粉

② 移入EP管中，+提取液（1ml Trizol +1%β-巰基乙醇+1% PVP），充分混勻，置于冰上

③ 每管+150μL無水乙醇+100μL 5mol/L的KAc（pH 4.8），混勻后緩緩+200μL氯仿/異戊醇（24:1），冰上靜置10min

④ 4℃、12000r/min離心20min，上層水相，+等體積的Tris飽和酚/氯仿(25：24)，輕搖5min

⑤ 4℃、12000r/min離心10min，上清轉(zhuǎn)到新EP管中，用氯仿/異戊醇（24:1）重復(fù)抽提至界面澄清

⑥ 上層液體+2/3體積的異丙醇+1/10體積的3mol/L NaAc（pH 5.2），-20℃沉淀3h

⑦ 4℃、12000r/min離心20min，沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌2次，晾干，20μL DEPC水溶解RNA

⑧ +180μL 0.3mol/L NaCl，混勻，RT離心20min，吸取上清，+2.5倍體積的無水乙醇和3mol/L NaAc（pH 5.2），-20℃放置30min

⑨ 4℃、12000r/min離心30min，沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌，晾干，50μL DEPC水溶解RNA

在研磨過程中加入PVP，其中的CO-N=基有很強的結(jié)合多酚的能力，從源頭上減少了酚類被氧化的機會。同時向抽提液中加入還原劑β-巰基乙醇，后者能打斷多酚氧化酶中的二硫鍵，使多酚不易被氧化，隨后經(jīng)抽提而去除。

借助鹽濃度來去除多糖的影響。首先在有裂解液和氯仿存在的條件下，RNase活性受到抑制，用低濃度的無水乙醇和Kac共同勻漿上清液中的多糖，通過離心 除去；并在沉淀RNA時兩次加入高濃度的NaAc，多糖在此溶液中會發(fā)生溶解，最后在低濃度NaCl中多糖會析出，從而有效去除了絕大部分的多糖。

2. 香蕉葉片 富含多酚類物質(zhì)、單寧、萜烯、色素、蛋白質(zhì)、多糖等

① 100mg香蕉幼葉置于預(yù)冷研缽中，+10mgPVPP,液氮中研磨成粉，移入EP管中，+提取液（1ml Trizol +10μL 1%β-巰基乙醇），充分混勻，RT靜置10min

② 4℃、12000r/min離心5 min，棄沉淀，200μL 5mol/L NaCl/1ml Trizol，混勻，+200μL氯仿/1ml Trizol，震蕩混勻，RT靜置15min

③ 4℃、12000r/min離心15min，取上層水相，+等體積的氯仿抽提

④ 4℃、12000r/min離心15min，取上層水相，+等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），混勻，RT靜置5min

⑤ 4℃、12000r/min離心15min，取上清，+0.5ml異丙醇/1ml Trizol，混勻，RT靜置5-10min

⑥ 4℃、12000r/min離心10min，棄上清，+1ml 75%乙醇/1ml Trizol，溫和震蕩離心管，懸浮沉淀

⑦ 4℃、8 000r/min離心5 min，棄上清，RT晾干，50μL DEPC水溶解RNA

⑧ 沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌2次，晾干，20μL DEPC水溶解RNA

⑨ +180μL 0.3mol/L NaCl，混勻，RT離心20min，吸取上清，+2.5倍體積的無水乙醇和3mol/L NaAc（pH 5.2），-20℃放置30min，取出后4℃、12000r/min離心30min

⑩ 沉淀經(jīng)75%乙醇洗滌，晾干，50μL DEPC水溶解RNA

加入10%的PVPP與材料共研磨，并在Trizol提取液中加入1%β-巰基乙醇，可以完全排除酚類物質(zhì)、色素等的干擾；并且增加了NaCl高鹽溶液沉淀和氯仿抽提，有效地去除了RNA中的多糖和蛋白質(zhì)。

3. 真菌（稻曲病菌） 富含RNase、多酚、多糖以及糖蛋白

① 2g香蕉幼葉置于預(yù)冷研缽中，液氮中研磨成粉，移入50ml離心管中，+20ml Trizol，用1ml移液器吹至液體澄清，且無細(xì)胞團塊， RT靜置10min

② +5mL氯仿/1ml Trizol，震蕩混勻15s，RT靜置3 min

③ 4℃、12000r/min離心15min，上層水相，+等體積的異丙醇，混勻，4℃靜置10min

④ 4℃、12000r/min離心10min，棄上清，沉淀經(jīng)20ml 75%乙醇洗滌2次，晾干，500μL DEPC水溶解RNA

改良：

a. 加入氯仿前添加5M NaCl高鹽溶液4ml，搖勻

b. 在沉淀RNA之前加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25:24:1)，混勻，RT 5min，4℃、12000r/min離心15min

4. 麻風(fēng)樹胚乳 富含油脂、蛋白和多酚、多糖等次生物質(zhì) 兩次裂解法

RNA提取液Ⅰ：100 mmol/L Tris-HCl，400 mmol/L NaCl，1.5%SDS，2%β-巰基乙醇，pH 7.5(β-巰基乙醇在操作前現(xiàn)加入RNA提取液Ⅰ中至終濃度為2%)

RNA提取液Ⅱ：4 mmol/L 異硫氰酸胍，25 mmol/L檸檬酸鈉溶液，0.5%(m/V)十二烷基肌氨酸

① 1-2顆(去除子葉)胚乳，液氮研磨成粉，移入EP管中，每管約加100mg，+600μL RNA提取液Ⅰ，渦旋振蕩混勻，+200μL酸酚(pH 4.3)+200μL氯仿，震蕩至徹底混勻，冰上放置5min

② 4℃、12000r/min離心10min，上清+500μL RNA提取液Ⅱ，震蕩混勻，冰上放置5min

③ 4℃、12000r/min離心5 min，上清+1/2體積5mol/L NaCl，搖晃，+1/2體積氯仿，震蕩混勻

④ 4℃、12000r/min離心10min，上清+等體積的異丙醇，溫和混勻，RT放置10min

⑤ 4℃、12000r/min離心10min，棄上清

⑥ 沉淀+1ml 70%乙醇，4℃、12000r/min離心1min，棄上清，晾干，30-50μL DEPC水溶解RNA

加入SDS以提高裂解效率，β-巰基乙醇濃度提高到2%希望能有效抑制內(nèi)源RNA酶活性，確保RNA不被降解

裂解提取液Ⅰ中，SDS通過使蛋白質(zhì)變性破壞植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，并能解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而使核酸游離在裂解體系中；

此外，NaCl的加入增加了溶 液的滲透壓，對RNA分子起到了很好的滲透保護作用，避免劇烈震蕩對其的破壞；

β-巰基乙醇則起到了抑制RNA酶活性和酚類物質(zhì)氧化的雙重作用，為確保得 到高質(zhì)量的RNA，我們將其濃度提高到2%。

而基于異硫氰酸胍法的提取液Ⅱ在提取液Ⅰ的基礎(chǔ)上進一步強烈抑制RNase的活性，確保RNA不被降解，并有 效地解離核蛋白與核酸的復(fù)合物。

等體積的酸酚和氯仿

氯仿有效地溶解了材 料中質(zhì)量較輕的油脂，使其分布于下層有機相中，便于之后吸取上清；酸酚的加入則提高了去除蛋白質(zhì)的效率，減少了氯仿抽提次數(shù)，只需一次氯仿抽提，就能使有機相和水相的界面清亮，徹底去除蛋白，節(jié)省了試驗時間，且降低了RNA的降解和損耗。另外，利用酸性酚還可以部分去除DNA，DNA殘留低有利于得到純度 更高的RNA樣品。

保留了利用高濃度的NaCl去除樣品中多糖的方法。

5. 柰樹 富含多酚類物質(zhì)、單寧、萜烯、色素、蛋白質(zhì)、多糖等

改良Trizol法1

① 1.0g嫩芽置于預(yù)冷研缽中，液氮中研磨成細(xì)粉末，+10% PVPP(0.1g),繼續(xù)研磨成粉末

② 移入大研缽中，預(yù)先裝有 8ml Trizol提取液+ 80μL 1%β-巰基乙醇，研磨成勻漿，+無水乙醇至終濃度為20%，繼續(xù)研磨混勻

③ 取1ml轉(zhuǎn)入EP管中，+200μL氯仿，震蕩混勻，RT靜置5min

④ 4℃、12000r/min離心15min，取上清約600μL，+500μL冰冷的異丙醇，混勻，RT靜置10min

⑤ 4℃、12000r/min離心10min，+70%乙醇洗兩次

⑥ 4℃、12000r/min離心5 min，棄上清，RT晾干，30μL DEPC水溶解RNA

改良Trizol法2

① 改良Trizol法1中第一次用氯仿抽提的上清中，再加入等體積的氯仿抽提

② 4℃、12000r/min離心15min，取上清，+10mol/L LiCl至終濃度為3 mol/L，混勻，4℃過夜沉淀

③ 4℃、12000r/min離心15min，棄上清，+適量的RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀

④ +適量3mol/L NaAc（pH 5.2），混勻，+適量冰冷的無水乙醇，混勻，冰浴30min以上

⑤ 4℃、12000r/min離心15min，取上清，+1/10體積的3mol/L NaAc（pH 5.2），混勻，+3倍體積無水乙醇，混勻，-70℃過夜沉淀

⑥ 4℃、12000r/min離心20min，棄上清，+70%乙醇洗兩次

⑦ 4℃、12000r/min離心5 min，棄上清，RT晾干，30μL DEPC水溶解RNA

改良Trizol法1的RNA樣品呈乳白色、粘稠狀；改良 Trizol法2的RNA樣品呈乳白色、半透明，說明在研磨材料時，加入10%PVPP與材料共研磨，并在Trizol提取液中加入β-巰基乙醇，可以完 全排除酚類物質(zhì)、色素等的干擾；但是改良Trizol法1的RNA樣品呈粘稠狀，這可能是存在多糖的干擾所致。

在研磨過程中加入PVPP，并在提取液中加入1%β-巰基乙醇，因為螯合劑PPVP分子中的CO-N=基能與多酚類物質(zhì)（如原花色素類物質(zhì)）芳香環(huán)上的羥 基結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，使多酚類不能成為PPO的底物而被氧化，并且在以后的抽提步驟中被除去。

同時β-巰基乙醇分子中的巰基能打斷PPO的二硫鍵使之 失活，從而防止了多酚類物質(zhì)的氧化。因此，所提的RNA樣品呈乳白色或白色，說明RNA樣品中多酚類物質(zhì)得到了有效的去除。

改良Trizol法2采用在勻漿液中加入終濃度為20%的乙醇沉淀多糖、在裂解液抽提的上相中加入終濃度為3mol/L LiCl沉淀RNA、在RNA的粗提液中加入適量的3mol/L NaAc（pH 5.2）和低濃度的無水乙醇沉淀多糖等方法相結(jié)合，可以有效地去除多糖的干擾，獲得純凈、完整的RNA樣品。

但在去除多糖的同時RNA也被裹攜走，造成 RNA產(chǎn)量的減少。

改良Trizol法1單獨采用在勻漿液中加入終濃度為20%的乙醇沉淀多糖的方法，不能將樣品中的多糖去除干凈，含有多糖的RNA沉淀難溶于水或溶解后產(chǎn)生粘稠狀的溶液。