mRNA純化

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3‘末端含有Poly（A+）的特點(diǎn)，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時(shí)，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時(shí)或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。

寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA：

試劑試劑：

1、3M醋酸鈉（pH 5.2）

2、0.1M NaOH

3、1×上樣緩沖液：20mM Tris-HCl（pH 7.6）；0.5M NaCl;1M EDTA（pH 8.0）；0.1%SLS（十二烷基氨酸鈉。配制時(shí)可先配制Tris-HCl（pH 7.6）、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時(shí)，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%.

4、洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl（pH 7.6）；1mM EDTA（pH 8.0）；0.05% SDS

5、無水乙醇、70%乙醇

6、DEPC

試驗(yàn)步驟：

1、將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。

2、用DEPC處理的1ml注射器或適當(dāng)?shù)奈埽瑢⒐丫郏╠T）-纖維素裝柱0.5-1ml,用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。

3、使用1×上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0.

4、將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2×上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。當(dāng)RNA上樣液全部進(jìn)入柱床后，再用1×上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。

5、將所有流出液于65℃加熱5min,冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。

6、用5-10倍柱床體積的1×上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無Poly（A）尾的RNA.后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。

7、用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫P(yáng)oly（A+）RNA,分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。

8、OD260測定Poly（A+）RNA分布，合并含Poly（A+）RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc（pH5.2）、2.5倍體積的預(yù)冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min.

9、4℃離心，10000g×15min，小心吸棄上清。用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時(shí)Poly（A+）RNA的沉淀往往看不到]。4℃離心，10000g×5min，棄上清，室溫晾干。

10、用適量的DEPC H2O溶解RNA.

注意事項(xiàng)：

1、整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程必須防止Rnase的污染。

2、步驟4中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個(gè)，一個(gè)是破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly（A+）尾處的二級結(jié)構(gòu)，使Poly（A+）尾充分暴露，從而提高Poly（A+）RNA的回收率；另一個(gè)目的是能解離mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。

3、十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl.

4、寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復(fù)使用。每次使用前應(yīng)該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。

5、一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細(xì)胞能提取1-5μg Poly（A+）RNA,約相當(dāng)于上柱總RNA量的1%-2%.