微量RNA的抽提RNeasy MinElute Spin Column（QIAGEN）
抽提微量RNA的柱子最大可以吸附45ug 的RNA。
·為了更好地裂解，細(xì)胞數(shù)不能大于5×105，細(xì)胞過多會減低產(chǎn)率和純度。
準(zhǔn)備工作：
1.在 24 ml 96－100％乙醇 中加入 6 ml 去RNA酶的水。
2.在每 1 ml Buffer RLT 中加入10 ml β-ME (加入β-ME的Buffer RLT可在室溫下放置1月)。
3. Buffer RPE中加入4倍體積的96－100％乙醇。
4.在 550 ml 的去RNA酶的水中加入1500 Kunitz單位的DNA酶1，輕輕翻轉(zhuǎn)試管混勻，勿振蕩（溶好的DNA酶1分裝后，－20℃可放置9個月，2－8℃可放置6周）
5.當(dāng)細(xì)胞數(shù)少于5000個，須在勻漿前在溶液中加入載體 RNA。
首次用時，在1ml 去RNA酶的水中加入 310 ug 載體RNA，則載體RNA的濃度為310 ug/ul，置－20℃保存。
實(shí)驗(yàn)時所需濃度為4ng/ul，配制如下：取5 ul 濃度為310 ug/ul的載體RNA，加入34 ul Buffer RLT，吹打混勻，再取 6 ul 稀釋液加入54 ul Buffer RLT，得終濃度4 ng/ ul，加5ul到第3步的溶液中。
微量RNA的抽提
步驟：
1.收集細(xì)胞：300×g離心5 min（ 離心管 自備），沉淀細(xì)胞，仔細(xì)吸去上清液。
2.加入Buffer RLT分散細(xì)胞。輕敲 試管 將沉淀弄分散，加入350 ul Buffer RLT振蕩或吹打混勻，
·當(dāng)細(xì)胞少于1×10 5 ，Buffer RLT可用75ul （可用小管），振蕩1 min 混勻，接第4步。
3.勻漿細(xì)胞：
細(xì)胞數(shù)少于5000個時，加20 ng 載體RNA ( 4ng/ul 溶液 5 ul)，到溶解液中。
3a 在柱子中加入溶解液，置于2ml收集管中，以最大速度離心2min；
4.加入1倍體積的（約350 ul）70％乙醇 到勻漿的液體中，吹打混勻（勿離心），
·若勻漿的液體有所丟失，相應(yīng)地減少70％乙醇的量，
·若第2步中用了75ul的Buffer RLT，則只用75 ul 70％乙醇。
5.將樣本（包括可能形成的沉淀）加入到柱子中（柱子放在一個2ml的收集管中），輕輕蓋上管蓋， 8000×g ( or 10000rpm)離心15s，棄掉過濾到收集管中的液體。收集管繼續(xù)用
6.加入350 ul的Buffer RW1 到柱子中，輕輕蓋上管蓋，8000×g（or 10000rpm）離心15s洗柱子，棄掉收集管中的液體，接第8步。
7.在70 ul Buffer RDD中加入 10 ul DNase 1溶液，輕輕翻轉(zhuǎn) 試管 混勻。（勿振蕩）
8.吸起上述 80ul 混合液加入柱子中的硅膠薄膜上，室溫放置15min。（勿加到管壁上）
9 吸350ul Buffer RW1 到柱子中， 8000×g（or 10000rpm）離心15s，棄掉收集管及收集管中的液體。
10.將柱子轉(zhuǎn)到1個新的2ml 收集管中，加500 ul Buffer RPE 到柱子中，輕輕蓋上 試管 8000×g（or 10000rpm）離心15s洗柱子，棄掉收集管中的液體，收集管再用。
11.加500 ul 80％乙醇 到柱子中，輕輕蓋上管蓋，8000×g（or 10000rpm）離心2 min 以使硅膠薄膜干燥，棄掉收集管及收集管中的液體。（柱子不要碰到收集管中的液體）
12.將柱子轉(zhuǎn)入1個新的2ml 管中，打開蓋子，以最大速度離心5min，棄掉收集管和管中的液體。
13.將柱子轉(zhuǎn)入1個新的1.5ml 的EP管中，加14 ul 去RNA酶的水到硅膠薄膜上，輕輕蓋上蓋子，以最大速度離心1min，將所得RNA溶液做逆轉(zhuǎn)錄或保存。
