RNA提取與Northern雜交

一、 總RNA的提取

1、 取組織10-50毫克，剪切成大小在0.5厘米以內的碎片，加入×5的RNA later（約2毫升）。樣品在37度可保存1天。室溫下1周，4度下1個月。

2、 勻漿：

用Rnase Erase spray（ICN）清理勻漿器頭部（7mm），用DEPC水和乙醇清洗，將上述樣品用鑷子轉移到消毒過的（無菌）盛有500微升tripure的管中，開始勻漿。將勻漿液轉移到Eppendorf doff中，另用500微升的tripure清洗管并且一并轉入到Eppendorf doff中，然后用DEPC水和乙醇清洗清理勻漿器頭部，防止樣品交叉污染。

3、樣品在室溫下靜置5分鐘。

4、每管加200微升三氯甲烷（氯仿），輕輕混合均勻，室溫下靜置培養15分鐘。

5、離心。4度，12 000g，15分鐘。

6、離心后，可見到三層：上層沒有顏色。中間層是白色。底層是紅色。用1毫升的吸管小心將無色的上清液轉移到另一個Eppendorf doff中，保留白色和紅色用于DNA和蛋白分析。

7、每管加500微升異丙醇，輕輕混合均勻，室溫下靜置5-10分鐘。

8、離心。4度，12 000g，10分鐘。

9、用1毫升的吸管棄去上清液，用75%乙醇清洗沉淀物，小心攪拌，盡量使沉淀物能夠漂浮在乙醇上面。

10、離心。4度，7 000g，5分鐘。

11、用1毫升的吸管棄去上清液，在空氣中干燥10分鐘。

12、用甲酰胺（做Northern）或者DPEC水（做RT-PCR）清洗沉淀物，劑量依RNA沉淀物的多少而定（范圍為50-500微升），樣品在55-60度下加熱10分鐘。然后保存在-80度冰箱中備用。

二、RNA凝膠和濃度檢測

檢測RNA的質量：檢測18s和28s核糖體RNA，樣品含總的RNA-rRNA、tRNA、mRNA。

1、1.2%檢測膠（check gel）（100毫升）

Agrose： 1.2g

10×MOPS 10ml

DEPC H2O 74ml

混合均勻，用微波爐加熱溶解，然后稍微冷卻。再加16 ml甲醛，混合均勻后，將溶液轉入凝膠容器中，發生聚合作用，約20分鐘。

當膠發生聚合作用后，加入1*MOPS將膠封住。

2、 Loading Buffer ：200ul（每個樣品10 ul）

10×MPOS 20 ul

甲醛 32 ul

甲酰胺 100 ul

Dye 40 ul

DEPC H2O 8 ul

Dye ： 0.2% 溴苯酚藍 50%甘油（丙三醇） 1m MEDTA

對于檢測膠：加1-2 ul EB，以便于樣品在UV光可以看清楚，可以看到兩條帶，18s：1，900bp和28s：4，900bp。

但是對于Northern膠，則不需要加EB。

3、RNA濃度檢測，將樣品保持在冰塊中。

光譜光度測量：石英玻璃杯中，加樣品4 ul，996 ul DEPC H2O，混合均勻后，讀取OD值。

型號：光度計

在2個波長260nm和280nm下讀取OD值。

比率（A260/A280）表示質量（一般在1.5），A260表示數量。

計算：在260nm波長下，1 OD=40ug/ml

0.229×40=9.16ug/ml

樣品稀釋度為1：250（4 ul：1 ml）

9.16×250=2290 ug/ml=2.29mg/ml

為了防止樣品檢測的相互污染，石英杯要用DEPC H2O清洗，并且用吸水紙吸干。

三、RNA電泳

1、樣品準備

5 ug RNA +10 ul Loading Buffer

例如：RNA濃度為2.29mg/ml

所以5 ug/2.29=2.18 ul

即2.18 ul樣品+10 ul Loading Buffer

65度，加熱，15分鐘，變性。

變性后將樣品至于冰塊中，

2、樣品loading

在膠的下面放一塊黑色的底片，可以看清楚背面。

在轉移的過程中間不能有氣泡。

電壓：90-110V，30分鐘。

RNA是負性變化的，所以它從負極（黑色）跑向正極（紅色）。

3、跑膠：

1.2% Agrose 膠 300 ml

Agrose 3.6g

10×MOPS 30ml

DEPC H2O 222ml

混合均勻，用微波爐加熱，加甲醛 48 ml，冷卻后轉入到凝膠容器中，發生聚合作用，約20分鐘。

當膠發生聚合作用后，加入1*MOPS封膠。

4、Loading buffer（10ul每個樣）

注： 不加EB

5、樣品準備

將樣品保持在冰塊中。

5ugRNA+ 10ul loading buffer

3等份分裝 Eppendorf doff 中 （1） 檢測 （2）28s 或者Actin （3）有用的RNA

變性：65度，10分鐘，然后將樣品放到冰塊中。

Prepare letter：： 1-2ul letter+10 ul loading buffer

Loading 樣品

小心將樣品轉移到泳道中，吸管頭部不能有氣泡

電壓：90-120V，1小時。