真核生物mRNA的純化以及cDNA文庫的構建
把帶聚腺苷酸的mRNA[(poly(A)+mRNA)經酶促反應轉變為雙鏈DNA，進而將此DNA導入原核載體，這一流程已成為真核分子生物學的基本手段。自20世紀70年代中葉首例互補DNA(cDNA)克隆問世以來，業已發展了許多旨在提高雙鏈cDNA合成效率的方法，并大大改進了載體系統。
最初，cDNA的合成與克隆并非易事，但隨著理論和技術在廣度上的進步，任何一個具一定實力的實驗室都可進行cDNA克隆。只要有少量mRNA即可照例建立起一個內容豐富的cDNA文庫。由于合成cDNA的酶促反應不斷得到改進，克隆長cDNA的方法日趨完善，目前已能分離到與長mRNA相對應的全長cDNA克隆。
cDNA是指以mRNA 為模板，在反轉錄酶的作用下形成的互補DNA（complementary DNA,簡稱cDNA）。若再以cDNA為模板，由大腸肝菌DNA聚合酶Ⅰ合成第二鏈，得到雙鏈DNA。由于制備的mRNA含有某種細胞的各種RNA分子，因而被合成的cDNA產物將是各樣mRNA 拷貝的群體，將其和載體DNA 重組，并轉化到宿主細菌里或包裝成噬菌體顆粒，得到一系列克隆群體。
每個克隆只含一種mRNA 的信息，足夠數目克隆的總合則包含細胞全部mRNA的信息,這樣的克隆群體叫cDNA庫。cDNA便于克隆和大量擴增，不像基因組DNA含有內含子很難表達，可以從cDNA庫中篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達。
一.實驗原理
構建cDNA庫主要包括以下幾個步驟：
①mRNA的分離；
②cDNA的第一鏈的合成；
③cDNA第二鏈的合成；
④cDNA與載體的連接；
⑤噬菌體的包裝及轉染或質粒的轉化。
1．mRNA的分離純化
RNA是一種極易降解的核酸分子，存在于細胞質及核中，提取RNA的方法有很多種,如熱酚法、一步抽提法等，或直接用公司提供的試劑盒。總的來說，分離純化mRNA的過程中始終要注意RNA酶污染的問題，可以使用RNA酶抑制劑加以抑制，例如DEPC(二乙基焦碳酸鹽)、酚、氯仿、去污劑、解偶劑、Rnase的特異抑制劑等。
利用高濃度前變性劑異硫氰酸胍可使細胞結構迅速被破壞，使RNA從細胞中釋放出來，同時核糖體蛋白也從RNA分子中解離下來，高濃度異硫氰酸胍和β-巰基乙醇還使細胞內的各種RNA酶失活，使釋放出來的RNA不被降解。
細胞裂解后存在于裂解液內的有RNA、核DNA、蛋白質和細胞殘片，通過酚、氯仿等有機溶劑處理，離心，使RNA與其它細胞組分分離開來,得到純化的總RNA。
哺乳動物平均每百萬個細胞可含5-10ug RNA 。其中 rRNA占 80%-85%，tRNA占10%-16%，而mRNA僅占1%-5%。 mRNA分子種類繁多，分子量大小不均一,但絕大多數mRNA分子均在3′端存在20-250個多聚腺苷酸poly(A),利用此特性，用寡聚（ dT）親和層析柱，很容易從總的RNA中純化mRNA分子。
2．cDNA的合成
Oligo (dT)纖維素柱分離純化的mRNA 3′`端都帶 poly(A)尾，以oligo(dT)12～18為引物，RNA為模板，就可在逆轉錄酶的作用下，復制出與mRNA互補的DNA即第一鏈。因為mRNA混合物中5′端沒有共同的特征序列，如果要合成與第一鏈cDNA互補的第二鏈cDNA，則不可能利用像oligo(dT)之類的引物而必須借助其它方法。
目前第二鏈合成采用的引物方式主要有以下四種：
1）利用第一鏈cDNA的3′`端形成發夾結構為引物自身引導合成互補的DNA鏈，最后用Dnase S1酶將發夾的單鏈環切除得到第二鏈cDNA，并形成雙鏈分子；
2 ）用RNase H1酶將RNA:DNA雜交分子中的RNA 切割成小片斷，以這些小片斷為引物，用DNA多聚酶合成第二鏈cDNA，并用DNA連接酶連接各小片斷DNA；
3） 用3′端DNA末端轉移酶在第一鏈cDNA 3′末端接上一個人工合成的寡聚核苷酸片斷，再用另一個與其互補的人工合成引物與其互補引導DNA 多聚酶1 合成第二鏈cDNA；
4） 在克隆載體上接有oligo(dT)6
3 .cDNA與載體的連接以及重組λ噬菌體的包裝和鋪板
第二鏈cDNA合成后，必須在DNA兩端加上帶合適酶切位點的接頭以供克隆、建庫時連接用。接頭處要以以下三種方式提供：
1） cDNA用接頭上相應限制性內切酶的甲基化酶將酶切位點甲基化，加雙鏈平頭接頭后酶即制備出帶粘性接頭的cDNA；
2）cDNA直接加合成的一端為平頭的粘性接頭即可；3）庫載體合成cDNA第二鏈時即提供引物又提供了接頭。通過第一、二鏈cDNA合成及加接頭等步驟，所得的cDNA含有大量的短的合成不完全或降解的DNA片段，必須將它門去除方可保證構建的cDNA文庫克隆有效片段及足夠大的庫容量。通常可以用凝膠過濾（分子篩原理）及低融點瓊脂糖凝膠分離純化兩種方 式處理，得到大于500bp以上的cDNA產物。
如果采用質粒DNA作為載體，cDNA與載體連接后可直接轉染宿主細胞，建立cDNA庫。若采用噬菌體為載體，必須經過體外包裝，形成噬菌體顆粒，感染宿主菌。包裝蛋白來自大腸桿菌BHB 2690和BHB 2688抽提液。
對于λgt10選用E.coli BNN 102宿主菌，沒有外源基因插入的載體在此菌中不能生長。對于λgt11載體則選用E.coli Y 1090為宿主菌，通過藍白斑確定有無外源基因基因插入。
包裝后必須測定噬菌體的效價，只有達到一定的效價，才能大規模地進行包裝、轉染，一旦cDNA庫建立，應進行效價測定并擴增。擴增后的cDNA庫克長期保存，并多次篩選。
現將cDNA文庫構建的整個過程概括如下：
二. 實驗材料與設備
（1） 材料
胚胎組織 載體λgt11 宿主菌 E.coli Y 1090
（2）用品與儀器
高速臺式離心機 PCR儀 超靜工作臺 恒溫水浴鍋 水浴循環器
恒溫培養箱 冰箱（4℃，-20℃） 超低溫冰箱（-80℃） 液氮罐
高壓蒸汽滅菌鍋 穩壓點泳儀 紫外分光光度計 快速混勻器
pH計 磁力攪拌器 取液器 研缽 天平
1.5mlEP管 Tip頭 燒杯 量筒 培養皿
（3）試劑
0.1%DEPC 水 液氮 mRNA純化試劑盒 cDNA合成試劑盒
Sephacryl S-400柱 0.5ug/uloligo(dT)15 10mmol/ldNTP
0.1mol/l DTT 大腸桿菌DNA連接酶 M-MLV反轉錄酶
T4DNA連接酶 T4多核苷酸激酶 20%甘油
α-32P-dCTP Sephadex G-50 LB培養基
SM緩沖液
三. 實驗操作程序
（1）用北京華美代理Promega公司的PolyATract ○RmRNA Isolation Systems 從人胚胎組織提取poly(A)+mRNA，具體方法參看產品說明書，紫外分光光度計(Perkin Elmer公司產品)測定其純度及含量.
（2）用 cDNA合成試劑盒AMV Reverse Transcriptase(Sangon公司)合成cDNA，具體方法參照說明書。
（3） 雙鏈cDNA(dscDNA)合成后加入T4DNA多聚酶，37℃保溫10 min，削平雙鏈cDNA的兩端， 在cDNA第1,2鏈的合成過程中均取出一小份反應體系，加入［α-32P］dCTP以示蹤cDNA合成的效果.
（4）用T4DNA連接酶將EcoRI人工接頭（從公司合成）與削平后的dscDNA連接，方法如下：
按順序加入各試劑，16℃連接16小時以上。
cDNA 18ul
5×接頭緩沖液 10ul
EcoRI接頭 12ul
0.1mol/l DTT 7ul
T4DNA ligase(200U/ul) 3ul
用Sephacryl-S400柱去除小于500 bp的cDNA片段及游離的EcoRI人工接頭，然后70℃滅活T4DNA ligase10分鐘，加3ulT4 polynucleotide kinase (10U/ul),37℃反應30分鐘，再70℃滅火10分鐘。
（5） T4多核苷酸激酶對連接上cDNA的人工接頭磷酸化后,再與去磷酸化的λgt11噬菌體左、右臂相連，連接反應體系如下：
cDNA 100ng
λgt11 1ug
10×T4噬菌體DNA連接酶緩沖液 2ul
加水至19ul 混勻，42℃保溫15分鐘，使λ噬菌體DNA退火，然后冰浴2分鐘，加1ul 20UT4噬菌體DNA連接酶（20 000U/ml）,于16℃連接過夜。
（6）從-70℃取出包裝蛋白，放在冰浴中融化，待包裝蛋白混合物完全融化后，立即加入cDNA進行進行包裝， 22℃保溫3 h包裝成噬菌體，反應完成后加入500ulSM及1滴氯仿，混勻后15000r/min離心2分鐘，包裝物于4℃保存。混合多份包裝產物建成重組λgt11噬菌體文庫.
（7） 取出1 μL的包裝噬菌體，按1：1000和1：10 000倍稀釋后感染對數生長期的E.coli Y1090，鋪平板，并在上層培養基中加入終濃度為5 g．L-1的IPTG和11 g．L-1的x-Gal,37℃培養過夜，次日數噬斑數目及藍、白噬斑之比，計算出文庫的大小，對于λgt11，籃斑應少于1/10。
（8）為了驗證插入的cDNA片段的平均大小，與構建文庫用的同一批cDNA加上EcoRI人工接頭后,與經內切酶EcoRI酶切并去磷酸化的質粒載體Bluescript SK相連，并轉化感受態細菌TG1，同樣鋪平板加入IPTG和X-Gal，37℃培養過夜，次日挑出9個白色細菌斑,分別接種入5 mL液體LB培養基中培養,小量提取質粒,并用內切酶EcoRI酶切后,進行瓊脂糖凝膠電泳以鑒定切出片段的大小。
（9）對上述構建的的cDNA庫進行擴增，取105個噬菌體轉染宿主菌E.coli Y 1090，鋪板，保溫后，加15MLSM,室溫振蕩2小時，回收SM，4℃5 000r/min離心30分鐘，以除去細胞碎片。分裝上情，每管1ml，各加20~30ul氯仿，緊塞管于4℃保存。
四. 討論
成功構建一個cDNA庫，mRNA的獲得是一個至關重要的因素。首先，mRNA必須完整，mRNA種類越多，構建的cDNA 庫就越完整，mRNA不能降解，可用Northern-blot 檢測，采用已知基因為探針進行檢測，雜交后的條帶應清晰，不出現拖尾現象；其次應注意mRNA不被DNA污染，即使是1ppm DNA的污染，也可嚴重影響其結果。
如果提取出的mRNA降解，可能與以下因素有關：器皿處理不嚴格、操作方法不嚴格、樣品不新鮮等。所有的RNA專用玻璃器皿都應常規洗凈后，應用0.1%的二乙基焦炭酸鹽（DEPC）浸泡處理（37℃，2小時），塑料器材使用滅菌的一次性塑料用品，操作者須勤換手套，配制的試劑都用0.1%的DEPC水配，處理過夜后，高壓滅菌，所有操作盡可能在冰浴中進行。
cDNA庫中有效重組噬菌斑的總數，常稱為cDNA文庫的容量，表達拷貝數為14個/細胞的基因，從文庫中篩選到的機率要達到99%時，cDNA文庫的容量一般要達到3.7×106（有效重組噬菌體是指克隆有目的cDNA的噬菌體）。
重組噬菌體中克隆cDNA的的平均大小，以人的組織材料為例，目前估計人的基因表達的mRNA平均大小為2000個堿基，所以它的cDNA文庫中克隆的cDNA平均長度要達到1200堿基以上 ，才能認為所構建的文庫為可用的文庫，通常用實驗操作程序中的（8）來檢測。
