RNA干擾技術(shù)的原理和應(yīng)用
馬鵬鵬 薛社普 韓代書
(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所, 中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞 生物 學(xué)系, 北京100005)
RNAi是由雙鏈RNA 所引起的序列特異性基因沉默。RNAi 首先由Fire 等發(fā)現(xiàn)于秀麗隱桿線蟲(C. elegans) 中, 他們發(fā)現(xiàn)將dsRNA 注入線蟲體內(nèi)后可抑制序列同源基因的表達(dá), 并證實這種抑制主要作用于轉(zhuǎn)錄之后, 所以又稱RNAi 為轉(zhuǎn)錄后基因沉默( postt ranscriptional gene silencing ,PTGS) 。
隨后人們陸續(xù)在果蠅(Drosophila) 、錐蟲( Trypanosomes) 、渦蟲( Planaria) 、斑馬魚( Zebrafish) 、擬南芥(Arabidopsis thaliana) 、大小鼠和人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了RNAi 現(xiàn)象, 遺傳學(xué)研究表明RNAi 是真核生物中一種普遍存在且非常保守的機(jī)制, 與真核細(xì)胞中許多重要生物學(xué)過程密切相通過對RNAi 現(xiàn)象的遺傳學(xué)與生物化學(xué)研究,其作用機(jī)制已日漸清晰。
Zamore 等利用果蠅胚胎提取物建立的體外系統(tǒng), 證實RNAi 是一個依賴ATP 的過程, 在此過程中, dsRNA (外源的或體內(nèi)產(chǎn)生的) 首先被降解為具5"2單磷酸、長21～23bp 的小分子雙鏈RNA , 這種RNA 分子稱為小干擾RNA , siRNA 通過堿基互補(bǔ)配對識別具同源序列的mRNA , 并介導(dǎo)其降解。
研究表明在生物體中siRNA 具相似的結(jié)構(gòu)特征: 為長約21～23bp 的雙鏈RNA , 具5"單磷酸和3"羥基末端, 互補(bǔ)雙鏈的3"端均有一個2～3nt 的單鏈突出。
在RNAi 過程中一種稱為Dicer 的核酸酶負(fù)責(zé)將dsRNA 轉(zhuǎn)化為siRNA , 它屬于RNase Ⅲ家族,具有兩個催化結(jié)構(gòu)域、一個解旋酶( helicase) 結(jié)構(gòu)域和一個PAZ ( Piwi/ Argonaute/ Zwille ) 結(jié)構(gòu)域, Dicer 在催化過程中以二聚體的形式出現(xiàn), 其催化結(jié)構(gòu)域在dsRNA 上反平行排列。
形成四個活性位點(diǎn), 但只有兩側(cè)的兩個位點(diǎn)有內(nèi)切核酸酶活性, 這兩個位點(diǎn)在相距約22bp 的距離切斷dsRNA , 各種生物體內(nèi)Dicer 結(jié)構(gòu)略有不同, 致使siRNA 長度存在微小差別。
siRNA 形成之后, 與一系列特異性蛋白結(jié)合形成siRNA 誘導(dǎo)干擾復(fù)合體( siRNA induced interference complex , RISC) , 此復(fù)合物通過堿基互補(bǔ)配對識別靶mRNA 并使其降解, 從而導(dǎo)致特定基因沉默。
在RISC 中, 起靶序列識別作用的是siRNA的反義鏈 , Zamore 等發(fā)現(xiàn)在RNAi 過程中,首先產(chǎn)生的是RISC 無活性前體, 分子量～250kD ,當(dāng)加入ATP 后可形成100kD 的活性復(fù)合體。由無活性前體向活性酶復(fù)合物的轉(zhuǎn)換類似蛋白酶原的激要求結(jié)合于其上的siRNA 雙鏈的解開。
在ATP 存在時, 依賴于ATP 的解旋酶解開siRNA 的雙鏈并將其正義鏈與靶mRNA 置換, mRNA 取代正義鏈與反義鏈互補(bǔ), 然后由活化的RISC 在互補(bǔ)區(qū)的中間, 距離siRNA 反義鏈3"末端約12bp 處切斷靶mRNA 序列。RNAi 效應(yīng)具有兩個明顯的特征, 特異性和高效性。干擾的高效性提示在機(jī)制中存在信號放大的步驟。
Fire 等早在1998 年便發(fā)現(xiàn)少量的dsRNA就能夠?qū)е戮€蟲大量的靶mRNA 降解, 但單憑少量dsRNA 被Dicer 降解為幾十個siRNA 并不能解釋這種高效性。許多研究顯示RNAi 過程中有新的dsRNA 分子的合成, 當(dāng)siRNA 反義鏈識別并結(jié)合靶mRNA 后。
siRNA 反義鏈可作為引物, 以靶mRNA 為模板在依賴于RNA 的RNA 聚合酶(RNA2dependent RNA polymerase , RdRP) 催化下合成新的dsRNA , 然后由Dicer 切割產(chǎn)生新的siRNA , 新siRNA 再去識別新一組mRNA , 又產(chǎn)生新的siRNA , 經(jīng)過若干次合成切割循環(huán), 沉默信號就會不斷放大 。正是這種稱為靶序列指導(dǎo)的擴(kuò)增( target2directed amplification) 機(jī)制賦予了RNAi 的高效性和持久性。
