改良熱硼酸鹽法提取RNA

（1）取3 g樣品，加入10% 樣品重的多聚聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），用液氮研磨成細粉狀，將細粉分為每份約3 g，并貯藏于-80℃下。

（2）在50 ml falcon管中加入20 ml提取緩沖液。提取液的組成為0.2 mol/L 脫水四硼酸鈉（sodium tetriborate decahydrate）、30 mmol/L 乙二胺四乙酸（EDTA）、1% （W/V）十二烷基硫酸鈉（SDS）、1%脫氧膽酸鈉鹽。

再加入0.0309 g二硫蘇糖（DTT）、200 ul乙基苯基聚乙二醇（NP-40）和0.4 g聚乙烯吡咯烷酮（PVP-40），并置于80℃下平衡15 min。

取出于-80℃中保存樣品，加入熱平衡后的提取緩沖液，振蕩混勻。再加入800 ul蛋白酶K（20 mg/ml ），蓋好管蓋，平放于轉速為120 r/min 、溫度為42℃搖床上，搖動提取1.5 h。

（3）之后，向樣品管中加人1.6 ml 2 mol/LKCl，振蕩混勻，將樣品管置于4℃條件下1~1.5h。將提取液轉移至玻璃離心管中，在4℃條件下以12 000×g離心20 min。取上清液置于新的玻璃離心管中，加入1/4（或1/3）體積8 mol/L LiCl（~20℃），振蕩混勻，于4℃放置過夜。

4℃下以12 000×g離心20 min，去除上清液，RNA沉淀滯留于管底。加入3~5 ml冷的2 mol/L （4℃）LiCl，輕緩振蕩，4℃下以12 000×g離心10 min，去除上清液。重復2 mol/L LiCl清洗2~3次，直到上清中無色素類物質。

（4）用2 ml 10 mmol/L。Tris-HCl（pH 7.5）充分溶解沉淀，4℃下以12 000×g離心10 min，去除不溶性的沉淀，將上清液轉移至15 ml玻璃離心管中，加入200 ul（1/10體積）的2 mol/L 醋酸鉀（pH 5.5）。于4℃溫浴中放30 min。4℃下以12 000×g離心10 min。

將上清液轉移至新的玻璃離心管中，加入2.5倍體積的100% 乙醇，搖勻并置于-80℃條件下沉降RNA 1~2 h。

（5）4℃下9 800×g離心30 min，去除上清液，RNA沉淀滯留于管底。用1~2 ml 70%冷乙醇（-20℃）清洗沉淀，4℃下9 800×g離心5 min，去除上清液。室溫下干燥RNA沉淀（20~30 min）至管內無水珠。

（6）用200 ul經過焦碳酸二乙醇（DEPC）處理的超純水充分溶解沉淀。溶解液完全轉移至1.5ml離心管中，再用100 ul經過DEPC處理的超純水清洗原管壁和管底，將清洗液合并于RNA溶解沉淀中，加入1/10體積3 mol/L 醋酸鈉（pH5.2）和2.5倍體積的100% 冷乙醇，混勻后放置于-20℃沉降RNA 1 h。

混合液在4℃下以16 000×g離心30 min，去除上清液，用1~2 ml 70% 冷乙醇（-20℃）清洗管底滯留的RNA沉淀，4℃下以9 800×g離心5 min，去除上清液，RNA沉淀滯留管底。

（7）RNA沉淀于室溫下干燥20~30 min。用適量經過EDPC處理的超純水（100~300 ul）溶解RNA沉淀，RNA液置于-80℃條件下可長期保存，或用于分析。