RNAi在哺乳動物中的應用

RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA(doublestrandsRNA，dsRNA)引起的，廣泛存在于動物植物中的序列特異性轉錄后基因沉默過程，是生物體在進化過程中，抵御病毒感染及由于重復序列和突變引起基因組不穩定性的保護機制。

Elbashir等[1]發現，一種稱為短干擾或小干擾RNA(smallinterferingRNA，siRNA)的RNA干擾中間體，能在果蠅中導致mRNA的降解。這種iRNA為21個核苷酸，形成19bp的雙鏈RNA分子，3′端有2個核苷酸突出(overhang)，可激活哺乳動物細胞的RNAi機制。

1 RNAi的機制

RNAi在哺乳動物中的機制基本上與果蠅和其他低等生物中RNAi的機制相似[2，3]?；静襟E由啟動和效應步驟構成[4]，啟動步驟為較長的雙鏈RNA經過RNA酶Ⅲ核酸酶(Dicer)處理后，降解成21～23個堿基的siRNA，siRNA與靶mRNA有高度的序列特異性。

siRNA在3′端有2個堿基突出。效應步驟為siRNA與RNA酶結合形成一個RNA誘導沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)，RISC是分子質量為50ku的內源性核酸酶，并與siRNA序列互補的內源性mRNA結合，核酸酶在siRNA2mRNA結合體3′端大約12個堿基處切割mRNA，使之喪失轉錄信息，達到特異性抑制目的基因表達效果。

2 RNAi在哺乳動物細胞中的應用

2.1體外合成siRNA

如何實現哺乳動物細胞中RNAi，目前使用得最多最廣泛的是siRNA雙鏈復合體(depluxes)。

siRNA雙鏈復合體是根據靶mRNA序列設計的21個核苷酸的雙鏈，由一條正義鏈和反義鏈組成，其中正義鏈19個核苷酸序列與靶序列相同，3′端有2個堿基突出，一般為UU或dTdT，反義鏈19個核苷酸序列與正義鏈互補，3′端也有2個堿基突出，一般為dTdT或UU，3′端dTdT結構對siRNA雙鏈復合體的穩定性有很大貢獻，而3′端UU結構有利于siRNA介導的基因沉默。

研究哺乳動物RNAi機制的學者建議，最有效的雙鏈siRNA序列應該是與靶mRNA序列互補的19個核苷酸序列，外加3′端2個堿基突出構成21個堿基的雙鏈RNA，研究表明[3]siRNA雙鏈的反義鏈具有識別靶點基因序列的功能，而正義鏈沒有序列識別功能。

在設計雙鏈siRNA時，通常將mRNA開放閱讀框區域作為作用靶點，從啟動子下游50～100個核苷酸開始搜尋理想的靶序列。為了避免mRNA調控蛋白的影響，3′端和5′端非翻譯區域或者啟動子不應該作為作用靶點。

Tuschl等在化學合成21～23ntsiRNA方面的研究取得了很好的成績[5]。目前已經有多家公司可以提供siRNA化學合成服務，比較著名的有Dharmacon(www。dharmacon。com)、Qiagen(www。giagen。com)、Proligo(www。

proligo。com)和Ambion(www。ambion。com)等。廠家可進行siRNA序列設計和合成，他們采用(AA2N19)標準進行siRNA設計，即19nt+dTdT或UU，19nt序列基礎上在3′端加2個堿基。

研究者也可以根據自己的需要進行設計，RNA最大合成堿基數量為80nt，為了防止siRNA的降解，siRNA通常采用了堿基保護措施，使用前根據試劑盒提供的緩沖液和步驟去保護。采用2′2ACE技術保護的合成RNA凍干粉，在-20℃可以保存1年。

另外，siRNA的保存時間與siRNA自身序列、所采用的保護方法、保存溫度等因素有關。2p-OH形式的RNA可以保存6個月。研究表明，以AA-N19標準設計的siRNA，在哺乳動物細胞中70%～80%有RNAi作用。

AA-N19設計原則:從啟動序列下游75個堿基開始尋找第一個AA序列，確定AA序列之后的19個堿基序列為目的序列;計算AA2N19221序列中的G/C含量比值，G/C含量應該在30%～70%之間，最好為50%。

如果在此序列中G/C含量不能達到要求，繼續尋找下一個AA序列，直到獲得滿意結果。在GenBank表達序列標簽(EST)數據庫中用BLAST檢索，確認所設計siRNA序列的唯一性。如果未達到要求，重新設計。

按照Tuschl等設計原則[5]，AA(N19)TT模式是最理想的siRNA序列，如果靶點基因序列中沒有理想中序列，AA(N21)或CA(N21)序列模式可以作為siRNA替代序列，由于雙鏈siRNA中的正義鏈并不參與靶點序列的識別，所以正義鏈的設計可以用dTdT替代。

已經有多個實驗室按照Tuschl等設計原則，設計的siRNA取得了很好的RNAi效果。但是從多個方面反饋的信息表明，siRNA的設計并不一定要嚴格遵守AA序列起始原則。QIAGEN公司根據現有的研究結果和客戶的反饋意見，對Tuschl的AA原則進行了修訂和補充。

認為mRNA 21個堿基中G/C含量應為50%，這比確定AA起始序列更重要。另外序列中應該避免連續同時出現3個鳥嘌呤堿基對，多個G序列重疊形成的多聚體將大大減弱siRNA的阻斷作用。以下是QIAGEN公司的siRNA設計原則。

第一，在mRNA編碼區選擇21個或23個堿基序列，序列中GC含量比值盡量接近50%。理想的GC含量比值為45%～55%，上限60%，超過70%作用明顯減弱。50～100nt的AUG啟動子和50～100nt的終止子區域應該避免。

第二，在一排序列中避免出現3個以上的鳥嘌呤。PolyG序列可以重疊，因此形成塊狀結構，嚴重影響siRNA的作用效果。第三，優先選擇AA起始序列。如果選擇AA起始，對應的siRNA3′端堿基突出可以為dTdT，從RNA合成的角度來講，可以大大降低RNA合成成本和增加siRNA對核苷酸酶的抵抗性。

如果難以發現AA起始序列和滿足第一、第二條原則，選擇另外23nt編碼區域，繼續按第一和第二條原則重新選擇。第四，確保所選靶序列與其他基因序列沒有同源性。在GenBank中用BLAST軟件查對，確保靶序列的唯一性。根據客戶的反饋意見，正義鏈3′端的標記不影響siRNA的效果。

依照上述原則設計的siRNA，80%有效。為了確保滿意的RNAi實驗效果，建議設計2條以上不同序列的siRNA。上述的設計沒有考慮mRNA的二級結構。研究表明[6]，相對于反義RNA和核酶技術，mRNA二級結構對siRNA的作用沒有明顯的影響。

體外合成的siRNA必需導入細胞內才能誘導RNAi，因此，如何有效地導入siRNA，成為研究熱點之一。研究表明，以往在基因治療中使用的載體可用于某些siRNA的導入[7]，目前使用最多的是陽離子脂質體載體。

2.2細胞內合成siRNA

由于體外合成siRNA在細胞內的作用，受到轉染技術和效率的影響，另外體外合成siRNA成本較高，體內表達短暫。因此研究者一直在尋找哺乳動物體內表達siRNA的方法，拓寬RNAi技術的應用范圍。研究表明，在體外構建siRNA表達載體，通過啟動子誘導表達，在細胞內產生siRNA，觸發RNAi，是一個切實可行的方案(圖2)[8～10]。

Brummelkamp等[11]采用RNA聚合酶ⅢH12RNA作為啟動子，用pSUPER質粒作為表達載體，以DNA為模板在哺乳動物細胞內合成siRNA，在10多種細胞中取得滿意的抑制特異基因表達效果，并且在細胞中表達時間長，對細胞無毒性。

設計插入序列時，環路結構(loops)的大小和序列至關重要，直接影響所得siRNA的抑制效果。在機制方面，認為首先由DNA模板產生一個stem2loop前體，在細胞中切割后，變成具有功能的siRNA。作者認為該技術是高通量篩選基因功能缺失表型的有效方法。

同樣，Paddison等[9]用發夾RNAs也取得了成功。將siRNA序列的DNA模板插入RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)的轉錄單位(基于核RNAU6或人類RNasePRNAH1轉錄單位序列)。

因此利用表達載體在哺乳動物細胞內合成siRNA是體外合成siRNA有效的替代方案，具有表達時間長、作用持久和成本低等特點，更接近生物體產生RNAi現象的自然機制，是未來RNAi研究的方向。