Northern Blotting反應
北方雜合反應的步驟主要包括:
(1) 加入核酸探針,使與固定于尼龍膜上的特定RNA 進行雜合反應;
(2) 待雜合反應結束后以含鹽緩沖液與SDS 洗掉非專一性結合于尼龍膜上的核酸探針。 進行反應時應注意下列幾個問題:
a. 實驗操作過程仍應盡可能避免RNase 的污染;
b. 反應前應先進行雜合前置反應(prehybridization),以便減少核酸探針與尼龍膜的間的非專一性結合反應;
c. 如果所使用的核酸探針是以random priming 或PCR 等方法所制備的雙股DNA 探針,使用前務必先加熱變性;
d. 選用適當的嚴苛度 (stringency) 進行雜合反應及后續的轉印膜漂洗工作,以便增強雜合反應訊息,并減少噪聲,這主要可以從溫度與鹽濃度兩個方面加以考量。
儀器用具:Crosslinker (Stratalinker 1800, Stratagene);塑料盒;平端鑷子;封口機;42℃恒溫槽;60℃恒溫槽
藥品試劑:6×SSC (0.9 M NaCl, 90 mM sodium citrate)尼龍膜;Hybridization solution [formamide, 50% (v/v); 5×SSC; blocking reagent, 2% (w/v);N-lauroylsarcosine, 0.1% (w/v); SDS, 0.02% (w/v)]3MM 濾紙;2×SSC, 0.1% SDS;0.1×SSC, 0.1% SDS
方法步驟:
1) RNA 轉印步驟結束后,移除電泳膠上的吸水紙與3M 濾紙。
2) 把尼龍膜連同電泳膠一齊移置于干凈衛生紙上,并請小心維持電泳膠與尼龍膜的相對位置。
3) 以防水筆在尼龍膜上標出電泳膠樣本孔的位置,并以剪刀剪掉尼龍膜左上角,以便標記電泳膠的左右方位。
4) 小心地拉開尼龍膜,將的放置于6×SSC (20 mL) 浸泡5 min.
5) 以平端鑷子夾起尼龍膜,待6×SSC 滴干的后,把尼龍膜平放于衛生紙上,風干至少30 min.與電泳膠接觸的那一面應朝上。
6) 以Stratalinker 1800 進行uv 連結反應。
7) 雜合前置反應:
a) 將10 mL 雜合溶液注入一個塑料袋。
b) 把已經風干的尼龍膜移置于塑料袋內,小心地把氣泡移除的后,以封口機密封好,再移至42℃恒溫槽進行雜合前置反應1~2 h.