肝中DNA的分離和鑒定

[原理]

細胞內的核酸多以核蛋白的形式存在，其中脫氧核糖核蛋白主要存在于細胞核中，核糖核蛋白主要存在于細胞質中。這兩類核蛋白在0.14mol／L氯化鈉溶液中的溶解度相差很大，核糖核蛋白在此溶液中具有很高的溶解度，脫氧核糖核蛋白的溶解度卻相當低。

制成肝勻漿后，用0.14mol／L氯化鈉溶液抽提，可將兩種核蛋白分離。分離過程中加入少量檸檬酸鈉，可抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的水解作用。

SDS(十二烷基硫酸鈉)能使脫氧核糖核蛋白產生解聚作用，在含有脫氧核糖核蛋白的溶液中加入SDS，DNA即與蛋白質分離開，用氯仿將蛋白質沉淀除去，而DNA溶解于水相，最后用冷乙醇將DNA析出，而獲得純化的DNA。

在氯仿中加入少量異戊醇能減少操作過程泡沫的產生，并有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白，下層有機溶劑相維持穩定。

DNA和RNA在波長260nm處有很高的吸收峰值，蛋白質則在280nm處有很高的吸收峰值。利用這個原理，我們測定純化樣品在260nm和280nm處的吸光度，可以推算出樣品中DNA的濃度，并判斷其純度。

用標準樣品測得在波長260nm處，1ug/ml 雙鏈DNA鈉鹽吸光度為0.02，單鏈DNA鈉鹽為0.025（光程為1cm），即A260＝1時，樣品中雙鏈DNA濃度為50 ug/ml，單鏈DNA濃度為40 ug/ml。純凈的DNA樣品A260/A280的比值約為1.8，樣品中含有蛋白質或其它雜質，會使A260/A280的比值下降。

A260/A280的比值大于1.6基本能達到各種后繼實驗的要求。

[儀器]

玻璃勻漿器 離心機 試管 刻度吸管 UV9100紫外可見分光光度計

[試劑]

(1)0.9％氯化鈉溶液。

(2)10％氯化鈉溶液。

(3)0.14mol／L氯化鈉溶液(含0.01 mol／L檸檬酸鈉)：稱取氯化鈉8.182g和檸檬酸鈉-2H2O 2.941g，用蒸餾水溶解并稀釋至1000ml。

(4) 95％乙醇溶液(冷藏)

(5)5％十二烷基磺酸鈉(SDS)溶液：稱取25克SDS溶于500ml 45％乙醇。

(6)氯仿-異戊醇混合液： 氯仿/異戊醇=24/1。

(7)0.1mol/L NaOH

[操作]

1．肝勻漿制備：新鮮兔肝，用0.9％ NaCl洗去血液，除去結締組織，剪碎，稱取4g肝組織，加4ml 0.14mol/L NaCl溶液，勻漿器中研磨，制成肝勻漿。

2．分離核蛋白：肝勻漿倒入試管中，4000rpm離心5min，上清棄去。沉淀加2 ml 0.14 mol/L NaCl攪勻后再置勻漿器中研磨，4000rpm離心5min，上清棄去，沉淀重復上述操作， 上清棄去，沉淀為DNA-蛋白質復合物。

3．沉淀中加0.14mol/L NaCl 2.0ml，攪勻，滴加5％SDS 2.0ml，邊加邊攪，60℃水浴10 min(不停攪拌)，冷至室溫，均勻分成兩管為Bl、B2。

4．B1、B。管中各滴加氯仿-異戊醇液4.0m1(邊加邊攪)，攪至溶液顏色均勻，3000rpm離心15min。溶液分三層，上層液為水相(含DNA)，中層為蛋白質沉淀，下層為有機相，吸取B1、 B2上層液合倒于另一試管中。

5．上清液加95％冷乙醇4.0ml，混勻(顛倒混勻法)，3000rpm離心15min，去上清液，沉淀為純化DNA。

6． DNA的溶解：沉淀中加入0.1 mol/L NaOH 4.0ml，攪拌溶解，2000rpm離心10min，上清液則為DNA水解液。

7．DNA的測定：用0.1mol/L NaOH 將樣品稀釋到一定濃度，以0.1mol/L NaOH 調零，測定樣品的A260和A280，計算出每克肝組織中的DNA含量，并判斷純化DNA的純度。

[注意事項]

(1)在制備肝勻漿時，應盡量在冰冷條件下進行，并盡快加入含0.01 mol 乙檸檬酸鈉的 0.14mol/L氯化鈉溶液，以抑制脫氧核糖核酸酶，防止DNA的分解以提高核酸得量。

(2)各步驟操作應力求準確，盡量減少中途核酸的丟失，保證定量測定的準確性+

(3)稀釋后應該盡量使樣品A260和A280處于0.1~0.7的范圍內。