shRNAs(short hairpin RNAs)在哺乳動物細胞中引發(fā)的基因沉默
Patrick Paddison, Greg Hannon
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, USA
介紹
RNA干擾(RNAi)首先在線蟲(Caenorhabditis elegans)和植物中發(fā)現(xiàn)，開始時認為是一種奇特的生物現(xiàn)象,但很快就成為這些生物系統(tǒng)強有力的基因研究工具。試驗證明dsRNA(double-stranded RNA)誘導的基因沉默廣泛存在于各種物種當中,包括植物、真菌、昆蟲、原生動物以及真核生物等[1] 。通過研究小片段干擾RNAs(siRNAs)和表達后的shRNAs在哺乳動物細胞中的作用，研究人員發(fā)現(xiàn)人或鼠基因組的任何基因都能成為dsRNAs誘導基因沉默的靶向基因。因此，RNAi很快成為哺乳動物細胞體系研究的標準實驗技術。
我們和其他一些實驗室構建了用于哺乳動物細胞產(chǎn)生小片段dsRNA的體內(nèi)表達載體,類似于內(nèi)源表達的hairpin RNAs[2]。在試驗中,我們利用U6 RNA polymerase Ⅲ啟動子產(chǎn)生的含有反向重復序列(21-29核苷酸)的轉(zhuǎn)錄子來形成shRNA，它能被Dicer加工并進入RNAi途徑。攜帶有shRNA表達載體的質(zhì)粒短暫轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞足以引起基因沉默。令人驚奇的是,應用不同靶定效率的shRNA，能產(chǎn)生類似表觀等位基因現(xiàn)象的一系列不同程度的基因沉默。
幾個因素可能影響基因沉默的效率,像靶序列的特征、轉(zhuǎn)染的效率以及靶向mRNA和蛋白的豐度及穩(wěn)定性。對于表達的shRNA,我們推薦每個靶基因采用3-6個不同的發(fā)夾結構。大部分情況下,至少一個shRNA能引發(fā)高于90%的基因沉默。然而,在進行生物學試驗前,一定要進行檢測(western blotting,免疫熒光或者RT-PCR)確認是shRNA引發(fā)基因沉默。對于轉(zhuǎn)染效率不高的細胞系,應進行多次轉(zhuǎn)染從而提高基因抑制的效率。對于單次轉(zhuǎn)染，應在轉(zhuǎn)染后的48-96小時內(nèi)進行基因抑制效率的檢測。這里，我們報道了利用FuGENE 6 轉(zhuǎn)染 試劑 轉(zhuǎn)染NIH/3T3細胞引發(fā)暫時基因沉默的一種簡單方法。
材料和方法
試驗通過用早幼粒細胞蛋白(promyelocytic leukemia protein， PML)特異的shRNA誘導基因沉默,所用 試劑 為FuGENE 6 轉(zhuǎn)染試劑, 細胞系為NIH 3T3,試驗程序如下:
細胞培養(yǎng)
NIH 3T3 細胞培養(yǎng) 用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
shRNA載體構建
PML,p53和Tyro29nt shRNA克隆入U6表達載體,方法參照Paddison和Hannon[2]
轉(zhuǎn)染
細胞培養(yǎng)在6-孔板，每孔含2ml的培養(yǎng)基，細胞濃度為1×10 5 /well，上板培養(yǎng)一天后進行轉(zhuǎn)染。
轉(zhuǎn)染試劑配置如下:在不含血清的DMEM培養(yǎng)基中稀釋的FuGENE 6試劑與500ng shRNA載體按3:1的比例混合，溫育15分鐘。
細胞轉(zhuǎn)染程序如下: 6-孔培養(yǎng)板的每孔中加入100μl含500ng shRNA載體(分別為PML-特異性的shRNA表達質(zhì)粒、p53質(zhì)粒或者Tyro29nt對照載體)的轉(zhuǎn)染復合物，轉(zhuǎn)染后16小時換培養(yǎng)基。
轉(zhuǎn)染48小時后從細胞中提取 總蛋白 ，細胞裂解液成份為0.2% NP-40、600mM KCl、50mM Hepes、0.2mM EDTA、0.2 mM EGTA和10% glycerol。其中另加入蛋白酶抑制劑(Complete Protease Inhibitor Cocktail)和deSUMOlase 抑制劑(2-lodoacetamide，calbiochem；N-Ethlymaleimide,Sigma)。
Western blotting
蛋白電泳采用8%的聚丙烯酰胺凝膠,上樣量為每孔25μg蛋白。電泳后,蛋白被轉(zhuǎn)移至尼龍膜。膜放置入封閉緩沖液TBST中(Tris緩沖液、5% 脫脂奶粉和0.05% 吐溫)，23℃溫育1小時。PML檢測的一抗為鼠PML單克隆抗體(mAb37,CSHL)，抗體用TBST緩沖液按1:250稀釋， 23℃溫育1小時。然后用洗液(TBST)洗3次,每次15分鐘。接下來將尼龍膜放入二抗溶液(鼠抗IgG HRP-conjugate，Upstate)，加入底物(Lumi-Light Western Blotting 底物),在X-ray膠片上檢測信號。
結果
U6表達載體形成的小于30bp的shRNAs引發(fā)序列特異性的基因沉默[4].圖1顯示用FuGENE 6轉(zhuǎn)染試劑誘導shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞48小時后PML的抑制情況。從圖可以看出,用PML-特異的shRNA表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細胞,PML的表達被強烈抑制。然而編碼p53或者Tyro29nt特異基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的細胞,PML的表達不受影響。
圖1:轉(zhuǎn)染PML特異性shRNA表達載體或p53-、Tyro29nt-特異性shRNA對照載體后，NIH3T3細胞 總蛋白 的Western blot
討論
利用shRNA技術引發(fā)的暫時基因沉默拓寬了現(xiàn)代基因抑制技術的范圍,給予研究人員在細胞學和疾病研究方面新的方向。我們的結果顯示，在載體介導的哺乳動物細胞基因沉默的研究中，F(xiàn)uGENE 6轉(zhuǎn)染試劑是一個有利的工具。
Reference
1. Hannon GJ(2002), Nature 11;418:244-251
2. Paddison PJ,Hannon GJ(2002), Cancer Cell 2:17-23
3. Hemann MT et al.(2003), Nat Genet 33:396-400
4. Passison PJ et al.(2002), Genes Dev 16:948-958
5. Paddison PJ et al.(2002), Proc Natl Acad Sci USA 99:1443-1448
