核糖核酸干擾技術(RNAi技術)介紹
轉錄后基因沉默（PTGS， post- transcriptional gene silencing）-最初被認為僅限于矮牽?；ê推渌恍┲参镏械钠娈惉F象，是目前分子生物學研究中一個最熱門的話題。過去幾年中，科研工作者已明確轉錄后基因沉默現象普遍存在于動、植物中，在機體防御病毒入侵和轉座子沉默效應中起著重要作用。但是最激動人心的是轉錄后基因沉默現象的技術應用，即在多種有機體中應用核糖核酸干擾（RNA interfere ,RNAi）技術進行特異性的基因剔除以研究相應的基因功能。那么核糖核酸干擾現象是如何被發(fā)現？它是怎樣工作的？科研工作者怎樣把它應用到功能基因組學的研究中呢？ 10多年前，Rich Jorgensan和他的同事在矮牽?；ㄖ邪l(fā)現一種奇怪的現象。他們嘗試把由一強有力啟動子控制的基因pigment-produing導入矮牽牛花以加深花的紫色，結果不但顏色未加深，許多花呈現雜色甚至白色。
Rich Jorgensan把這種現象稱為"共抑制"，因為外源性導入基因和內源性具有相似功能基因的表達都被抑制了。當時人們不知道這是一種轉錄后基因沉默。雙鏈核糖核酸能導致轉錄后基因沉默首先來自于對線蟲的研究。1995年Guo和Kewphues試圖用反義核糖核酸來阻斷Par-1基因的表達以研究其功能。確實反義核糖核酸抑制了基因表達，出乎意料的是用作陰性對照的正義核糖核酸也抑制了基因表達。該結果一直讓人迷惑不解，直至三年后Fire和Mello進行了另一實驗才真正提出雙鏈核糖核酸能導致轉錄后基因沉默的理論。Fire和Mello發(fā)現把反義核糖核酸和正義核糖核酸的混合物導入線蟲后，其抑制效應遠遠強于單獨導入反義核糖核酸或正義核糖核酸的抑制效應。再后來Baulcomb和Hamilton首先發(fā)現是~25nt的核糖核酸能特異性抑制具有相應互補序列的基因表達。那么核糖核酸干擾（RNAi）是怎樣工作的呢？首先外源導入的雙鏈核糖核酸(dsRNA)被切割為21~23nt的小分子干擾核糖核酸(siRNA)。Dicer, 作為特異性核糖核酸酶家族的一個成員，切割雙鏈核糖核酸為19~23nt小分子干擾核糖核酸（siRNA），這是一個依賴ATP的耗能過程. 切割后的 siRNA具有3'兩個核苷酸TT突出末端。然后siRNA結合到核糖核酸酶復合物上形成RNA誘導的基因沉默復合體（RISC，RNA-induced silencing complex）。該復合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC?；罨腞ISC通過由siRNA決定的堿基互補配對原理切割具有同源序列的基因轉錄體，最終導致基因沉默效應。目前具體的切割機制還不明了，研究表明每個RISC包括單鏈siRNA和核糖核酸酶RNase。.
由于RNAi強大的基因沉默效應，有人提出了RNAi通路的效應擴增問題。RNAi通路的效應擴增可能是通過細胞復制外源導入的dsRNA或siRNA本身而實現的。
另外，RISC的多次反復使用也能擴增RNAi的基因沉默效應。 科研工作者已開始RNAi效應增強子和效應抑制子的研究，認為RNAi是機體細胞一種強有力的基因調控機制。但是在哺乳細胞中外源導入大分子dsRNA（>30nt）常常導致非特異性的基因沉默效應，因為它激活了核糖核酸酶RNaseL而導致非特異性的RNA降解。相反，siRNA（<30nt）不激活RNaseL，而是通過序列特異性的方式誘導基因沉默效應。該序列特異性方式非常嚴格，一個堿基的錯配會顯著降低基因沉默效應。所以siRNA可以解釋如下，它是一種具有3'兩個核苷酸TT突出末端的21~23nt大小的雙鏈核糖核酸，作為RNAi的中介分子，通過序列互補配對法則特異性降解目的基因。siRNA可以經化學合成，比如著名生物學公司Proligo、Orbigen在siRNA合成方面處于世界領先水平，它們既提供即用型siRNA，也提供標記生物素、熒光素和磷酸等的siRNA更方便監(jiān)測其抑制特異基因表達的效果siRNA也可以通過體外轉錄獲取。它相對便宜，尤其適合于同時合成多個siRNA。雖然理論上說，任何一個具有3'兩個核苷酸TT突出末端的19~23nt小分子干擾核糖核酸 siRNA都具備序列特異性的基因沉默效應，但是由于位置效應，比如某些序列，尤其是調控序列易被蛋白質附著而阻止RISC的抑制效應，所以科研工作者首先合成2~4個siRNA進行預實驗以選定作用最佳者。RNA專家Ambion公司提供通過體外轉錄獲取siRNA的商品化試劑盒，使這一選擇過程簡單方便。
目前外源注射和轉染是轉運siRNA到細胞或機體的主要途經，之后基因沉默效應可以持續(xù)數天，同時傳至下一代細胞，但終將短時間內消失，因此，最近許多科研小組開發(fā)了siRNA的表達質粒，通過瞬時轉染或穩(wěn)定轉染以達到在細胞內不斷表達siRNA的目的。有些質粒是表達小發(fā)夾結構RNAs（shRNAs, small hairpin RNAs）, 在細胞內它被加工處理為siRNA樣分子，誘導基因沉默。該質粒是在polyMeraseⅢ啟動子和4~5個堿基T轉錄終止信號中插入shRAN。
由于polyMeraseⅢ的特性，轉錄常常在第二個T終止，插入序列折疊成step-loop結構并帶有3'-UU突出末端。該質粒設計是基于線蟲、果蠅等中的實驗結果，因為其中的基因沉默效應就是通過step-loop而誘導。另外一種siRNA表達質粒是把編碼正義和反義的siRNA分別受控于各自的polyMeraseⅢ啟動子。兩種質粒的基因沉默效應相當。Invivogen公司和Imgenex公司都有操作簡單、作用有效的商品化試劑盒提供。而Gene Therapy System 公司的siRNA構建試劑盒則完全采用了不同的機制。該試劑盒首先PCR合成目標序列，然后由T7RNA多聚酶進行體外轉錄，經退火和純化處理的體外轉錄dsRNA模板被重組的Dicer酶切割，從而快速、高效地產生大量小分子干擾RNA（siRNAs）。產生的siRNAs混合物，比單一形式的siRNA更可能導致基因表達沉默?；谀壳暗陌l(fā)表文獻和一些實驗經驗，siRNA的設計可遵循以下幾點進行
1）選擇以堿基A或G開始的19~21nt大小的目的mRNA。因為RNA polyMeraseⅢ啟動子只有在第一個轉錄堿基是嘌呤時才能有效作用。
2）針對目的mRNA一般選擇2~4個不同序列，GC含量為30~50%，避免四個堿基T或A的連續(xù)序列，避免選擇起始密碼下游50~100nt、終止密碼上游100nt以及5'和3'的非編碼區(qū)域，BLAST檢查設計序列的特異性。
3）設計適當的實驗對照，比如設計有1~2個堿基錯配的序列，或者是隨機變更siRNA的堿基排列順序。RNAi的研究刮起了科學界的風暴，siRNA迅速有效抑制特異基因功能的性質促使科研工作者不斷深入完善該領域的研究。RNAi可能是未來發(fā)展基因治療策略的新希望所在。RNAi技術必將帶來功能基因組學的革命。
