siRNA與RNAi綜述

1 前言
RNA是生物體內最重要的物質基礎之一，它與DNA和蛋白質一起構成生命的框架。但長久以來，RNA分子一直被認為是小角色。它從DNA那兒獲得自己的順序，然后將遺傳信息轉化成蛋白質。然而，一系列發現表明——這些小分子RNA事實上操縱著許多細胞功能。它可通過互補序列的結合反作用于DNA，從而關閉或調節基因的表達。甚至某些小分子RNA可以通過指導基因的開關來調控細胞的發育時鐘。
2 綜述
2.1 研究歷史與發展前景
2.1.1 定義
雙鏈RNA對基因表達的阻斷作用被稱為RNA干預（RNA interference, RNAi ）雙鏈RNA經酶切后會形成很多小片段，稱為siRNA，這些小片段一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補結合，會導致mRNA失去功能，即不能翻譯產生蛋白質，也就是使基因“沉默”了。
2.1.2 研究歷史
RNAi現象早在1993年就有報道： 將產生紫色素的基因轉入開紫花的矮牽牛中，希望得到紫色更深的花，可是事與愿違，非但沒有加深紫色，反而成了白色。當時認為這是矮牽牛本來有的紫色素基因和轉入的外來紫色素基因都失去了功能，稱這種現象是“共抑制”。1995年，康奈爾大學的Su Guo博士用反義RNA阻斷線蟲基因表達的試驗中發現，反義RNA（anti sense RNA和正義RNA（sense RNA）都阻斷了基因的表達，他們對這個結果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire的研究證明，在正義RNA阻斷了基因表達的試驗中，真正起作用的是雙鏈RNA。這些雙鏈RNA是體外轉錄正義RNA時生成的。于是提出了RNAi這個詞。
2.1.3 作用機理
目前RNAi的作用機理主要是在線蟲，果蠅，斑馬魚等生物體內闡明的。生物體內的雙鏈RNA可來自于RNA病毒感染，轉座子的轉錄產物，外源導入的基因。這些來源的雙鏈RNA誘發了細胞內的RNAi機制，結果是病毒被清除，轉座子的表達被阻斷，外源導入基因表達被阻斷同時，與其同源的細胞基因組中的基因表達也被阻斷。
雙鏈RNA進入細胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP（以RNA為模板指導RNA合成的聚合酶，RNA-directed RNA polymerase）的作用下自身擴增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的雙鏈解開變成單鏈，并和某些蛋白形成復合物，Argonaute2是目前唯一已知的參與復合物形成的蛋白。此復合物同與siRNA互補的mRNA結合，使mRNA被RNA酶裂解 （如下圖）
另一方面結合的產物以SiRNA作為引物，以mRNA為模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互補鏈。結果mRNA也變成了雙鏈RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。這些新生成的siRNA也具有誘發RNAi的作用，通過這個聚合酶鏈式反應，細胞內的siRNA大大增加，顯著增加了對基因表達的抑制。從21到23個核苷酸的siRNA到幾百個核苷酸的雙鏈RNA都能誘發RNAi，但長的雙鏈RNA阻斷基因表達的效果明顯強于短的雙鏈RNA。
siRNA還能夠通過某種不太明了的機制永久地關閉或者刪除DNA片斷，以在非常大的程度上控制染色質的形成，而不是僅僅暫時地抑制它們的活動。
動植物和人體的病原體中有一些是RNA病毒，如導致艾滋病的HIV和SARS的冠狀病毒都是RNA病毒。有些RNA病毒在復制過程的一定階段中會產生雙鏈RNA。如果宿主體內有分解這種雙鏈RNA的酶，就可將雙鏈RNA切割成許多小的片段，這種小片段會與病毒RNA基因組的同源部分結合，使病毒基因失去復制功能，也就不能危害宿主。所以RNAi是自然界生物長期進化形成的一種防御機制。
2.1.4 現狀與未來
2.1.4.1 疾病治療
用RNAi來制備藥物。其思路是根據病原體如病毒、細菌等的致病基因序列，以及生物體內與疾病發生相關的基因序列，設計和制備與這些基因序列有同源序列的雙鏈RNA，轉入動植物內使有關的疾病基因“沉默”(不能表達功能)，從而達到治療的效果。
以治療HIV為例，理論過程如上圖所示。原理是利用siRNA抑制病毒再生或傳染所需的蛋白質的生成。它的優勢在于能夠不損傷細胞而只抑制病毒蛋白質，其專一性是其他藥物所難以具備的。但問題在于目標基因的選擇，即如何篩選出針對致病蛋白質而不影響細胞正常的新陳代謝的siRNA。而且艾滋病毒變化迅速，目標 RNA 序列有可能在短時間內失效，這都給篩選提出了巨大的挑戰。
對其他病毒的治療也存在類似的問題，如SARS等。目前研究大都處于初期階段，只在離體細胞或簡單的真核細胞上做過試驗，況且哺乳動物與人體的RNAi機制尚未清晰，所以利用siRNA制備藥物潛力巨大但前路漫漫。
2.1.4.2 生物進化
在許多真核生物中都發現了RNAi現象，而在原核生物中卻未發現，提示了RNAi的進化地位，但是其在進化中是如何出現的，如何保存下來的，在生物體中的意義有多大，目前均沒有分析清楚，還需要更多的研究來闡明。
siRNA的出現重新喚起了科學家們對“RNA世界”的重視及對“生命起源于RNA分子”這一命題的興趣。有的科學家認為成千上萬非編碼蛋白質的RNA分子組成了巨大的分子網絡調節著細胞中的生命活動，它們與蛋白質-蛋白質相互作用網絡相對應，將為基因組和生命科學研究提供無比美好的前景。
2.1.4.3 干細胞與細胞分化
很容易聯想，siRNA與細胞分化必然有著極其重要的聯系，即有可能參與了細胞周期調控機制。
研究者發現，RNAi在Epigenetics中發揮重要作用。Epigenetics是指：至少一代的基因表達改變，而基因的編碼不變。epigenetics調控的一種類型是染色體的改變。通過改變染色體的形狀（更緊或是更松），來決定哪一個基因表達。siRNA在染色體形狀的改變中起著非常重要的作用。
RNAi已被證實能引導植物干細胞的分化，因而研究者認為RNAi也可能參與指導人的干細胞的分化。由于RNAi在基因表達調控中發揮重要的作用，對RNAi微小的干擾就可能導致腫瘤的發生。干細胞和腫瘤細胞都有共同的特性，例如可塑性和自身更新的特性。這說明它們可能有類似的細胞內分子機器。
一些研究者把針對P53抑癌基因的雙鏈RNA引入胚胎干細胞，使得干細胞中的P53基因受抑，最終使干細胞發育成腫瘤細胞。一個有趣的現象是，P53受抑制的程度與干細胞發育成腫瘤細胞的進程、惡性程度成正相關，若P53受抑程度小，變成腫瘤的速度就慢，且惡性低。
2.2 問題與猜想
2.2.1 問題
在siRNA與RNAi的研究中，仍有許多的問題：
蛋白是如何與siRNA組合在一起的，如何成為活性形式？對靶RNA的剪切作用，其相關的分子機制如何，是需要特異的蛋白來剪切靶RNA，還是引導的siRNA本身即有剪切作用等。
哺乳動物與人的RNAi機制是否與簡單的真核生物類似，RNAi的進化地位如何等。
2.2.2 猜想
1、 疾病治療：主要的問題還是轉運系統的選擇，如何找到一種高效而低毒的用于人體的轉運載體是擺在所有RNAi應用面前的最大敵人。依靠免疫系統尋找轉運載體可能成為途徑之一，而免疫系統中本身可能也有RNAi參與。細胞中是否普遍存在RNAi或進行RNAi的潛力呢？細胞的凋亡機制可能也與RNAi有關。
病毒的蛋白質復制途徑可能有多種，RNAi是否能像人們期待的那么有效？
2、 如果siRNA可以永久地關閉或者刪除DNA片斷，而不僅僅是短期的抑制它。那么動物細胞全能性受抑制的程度可能遠遠高于過去人們所想象的。干細胞的可塑性可能是由于可以產生特異的siRNA或其前體。干細胞通過細胞內的RNAi機制在發育過程中關閉或開放基因的表達，從而指導著細胞的定向分化。其中的siRNA有可能來自DNA的內含子。
3、 在研究基因時，可通過短期的抑制干細胞某個基因的表達來得知其功能。
3 結論
siRNA與RNAi技術真正能應用于日常生活為時尚早，還需要科學家們進一步廣泛深入細致持久的研究。盡管如此，我們依然可以預測，與其它基因技術一樣， siRNA與RNAi技術將在不久的將來會在基因治療和基因應用中發揮極大的作用，并將給整個生物理論帶來巨大而深遠的影響。
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