總RNA的提取方法
具體步驟:(關(guān)鍵是防止RNA酶的污染)
⑴
1) 稱(chēng)取-85℃冰凍保存的標(biāo)本50-100mg,于液氮中夾碎(用剪刀將組織塊剪成若干碎塊)(須避免RNA酶的污染)。
2) 將組織碎塊加入1ml TRI zol變性緩沖液中(所加組織塊的體積不能超過(guò)TRIzol體積的10%),在玻璃勻漿器中充分研磨至無(wú)明顯大的組織塊為止,研磨過(guò)程在0℃冰水中進(jìn)行,以防止組織RNA被降解。
⑵ RNA的分離
3) 然后將組織勻漿液轉(zhuǎn)移到1.5ml的Eppendorf管中,室溫靜置5min,使核蛋白復(fù)合體完全分離。
4) 加入0.2ml的氯仿,蓋緊蓋子,充分搖勻15秒左右,配平,室溫靜置2-3min 。
5) 4℃冰凍離心機(jī)中離心(12000g/min,15min)。此時(shí)可見(jiàn)液體分層:底層——紅色酚-氯仿相;中間層——粉紅色的交界相;上層——無(wú)色液相(RNA全部在此相中)。
⑶ RNA的沉淀
6) RNA僅存于上清中。將上清轉(zhuǎn)移至新管(1.5ml的Eppendorf管)中(切勿將中間層誤吸入),
7) 加入0.5ml的異丙醇,充分混勻,配平,室溫靜置10min。
8) 4℃冰凍離心機(jī)中離心(12000g/min,15min)。
9) 棄上清(動(dòng)作輕,慢),在管底部可見(jiàn)一乳白色小沉淀物,即為RNA。
⑷ RNA的清洗
10) 加入1ml 75%乙醇,混合震蕩,(可在2℃-8℃中保存一周,-15-25℃中保存一年)
11) 4℃冰凍離心機(jī)中離心(7500g/min) 5min,棄上清。
⑸ RNA的再溶解
12) 通風(fēng),室溫中干燥5min-10min,讓乙醇揮發(fā)(根據(jù)肉眼觀(guān)察管內(nèi)水分情況,不能太干,RNA干后難溶解)。
13) 加入10ul的0.1%的DEPC處理水溶解RNA。
14) 供下一步實(shí)驗(yàn)使用或-70℃凍存。
RNA完整性的檢測(cè)(應(yīng)用檢測(cè)DNA完整性的方法進(jìn)行):
1) 電泳槽的處理:
做RNA電泳時(shí)先用肥皂水洗凈,無(wú)水乙醇沖洗,自然干燥后用3%雙氧水浸泡15分鐘,再用DEPC處理水沖洗即可。
做DNA電泳時(shí),先用肥皂水洗凈,無(wú)水乙醇沖洗,自然干燥后即可使用。
2) 配置50*TAE緩沖液
50×TAE配方:
Tris 24.2 g
冰乙酸 5.71 mL
0.5mol/L EDTA (pH8.0) 10mL -------1.861 g--------NaOH調(diào)節(jié)PH值到8.0 分子量372.24*0.5*0.01=1.861 g
加DEPC處理水 加至1 00mL 應(yīng)用時(shí)用DEPC處理水稀釋50倍使用
3)制備凝膠(1%瓊脂糖凝膠)
稱(chēng)取瓊脂糖300/500mg,加入1×TAE 30/50ml中,微波爐加熱至融化(中火1分鐘),冷卻至60℃,加入EB嗅已啶(10mg/ml)1.5 /1.8ul,混勻,倒入電泳槽中,室溫30分鐘以上至凝固,最終配成濃度為1%瓊脂糖凝膠。
4)加2 μl 滅菌的并經(jīng)用DEPC處理的加樣緩沖液于10μLRNA樣品中,混勻后加樣于1%瓊脂糖凝膠加樣孔中。
加樣緩沖液配方:
50%甘油 5ml
1 mmol/L EDTA(PH值8.0) 20ul
0.25%溴酚藍(lán) 25mg
0.25%二甲苯青FF 25mg
5) 在1%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行水平電泳,電壓5V/cm,電泳時(shí)間約40分鐘。
6)在可見(jiàn)/紫外線(xiàn)檢測(cè)儀254nm紫外光透視下,對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀(guān)察。應(yīng)可見(jiàn)真核細(xì)胞核糖體RNA中的28s 和18s RNA 兩條清晰條帶。所得結(jié)果用相機(jī)拍攝存檔。