非哺乳動物細胞體系的RNAi實驗和選擇
比如果蠅，線蟲，擬南芥等低等生物和植物，由于不涉及抗病毒免疫應答反應，通過體外轉錄即可制備目標基因的dsRNA(通常200bp或以上)，直接用長雙鏈RNA進行RNAi實驗，不需要另外設計siRNA，因而比較簡單。長雙鏈RNA的制備很容易，省掉了設計合成單個siRNA的麻煩，并且長雙鏈RNA在生物體內會被Dicer酶降解為多個siRNAs混合物，因而往往比單個siRNA更有效。長鏈dsRNA的遞送方法依細胞種類而異，果蠅培養細胞轉染、飼喂或者浸泡線蟲、乃至顯微注射等方法均可將dsRNA遞送到目標細胞。dsRNA得到的是瞬時基因沉默。
體外轉錄：
常規的體外轉錄試劑盒通常是為體外轉錄合成單鏈mRNA而設計的，你可以分別合成2條單鏈RNA，再合并退火。不過你也可以將兩個帶相同啟動子的模板合并一起做體外轉錄，最后再退火而得到dsRNA，還可以節省試劑。另外如果PCR時在模板兩頭帶上同樣的RNA聚合酶啟動子，就可以用同一個模板在體外轉錄過程中同時合成雙鏈dsRNA，省卻退火一步，結果只是dsRNA兩端多了啟動子的序列。我們也可以將片段克隆到帶2個反向相同RNA聚合酶啟動子之間的載體上達到同樣的目的。體外轉錄試劑選擇的要點就是產量，速度；由于要避免dsRNA部分序列和其他基因重疊，避免非目標基因的沉默或者脫靶，通常不會選擇太長的片斷作為dsRNA的模板，因此對試劑盒合成dsRNA的長度，倒是不一定要求太高。
1. 號稱RNA公司的Ambion是最早推廣RNAi試劑的廠家之一，去年初被生命科學領域的巨頭ABI以2.73億美金高價收購其RNA部門而震動業界，2006和2007年連續成為美國The Scientist雜志最受歡迎的RNAi產品品牌大獎，可見其產品聲譽和影響力之大。Ambion特別為非哺乳動物細胞體系的RNAi實驗推出了MEGAscript RNAi Kit（20rxns），以目標基因兩端帶T7聚合酶的PCR產物或者質粒為DNA模板，提供除模板外，體外轉錄反應涉及的各種試劑，每次反應可得到高達80ug的純化的dsRNAs，最長可達1.2kb。體外轉錄得到dsRNA后，利用試劑盒提供的DNase和單鏈特異的RNase降解反應產物中的DNA模板和單鏈未配對的RNA，最后用試劑盒提供的純化柱去除蛋白質，核苷酸等雜質后得到純化的、立即可用于RNAi實驗的dsRNA。這個試劑盒的特點是Ambion專利的MEGA體外轉錄技術，使得產量高于普通體外轉錄試劑盒，試劑盒包含了體外轉錄合成dsRNA和后繼純化所需試劑，包擴DNase（消化DNA模板），單鏈特異的RNase（用于消化未匹配為雙鏈的單鏈RNA），和RNA純化柱等成分，對以異常敏感的RNA實驗來說可以省卻不少麻煩。4600RMB/20次反應(每次反應成本230多，不計折扣)，——用這種方便齊全又好用的試劑盒做實驗，實驗過程也是快樂流暢滴。至于付款時的煩惱，留給親愛的老板吧。
2. 紐英倫（New England Biolabs）的HiScribe RNAi試劑盒也是一個合成雙鏈RNA的試劑盒。這個盒子的特點在于提供了LITMUS克隆載體，這個載體多克隆位點的兩端有反向T7啟動子序列，將目標基因克隆到載體中后，即可以用試劑盒提供的T7引物PCR得到兩端帶T7序列的模板，也可以分別用T7啟動子后的2個酶切位點分別單酶切線性化質粒，使酶失活后再混合，得到2種不同的模板，再同時進行體外轉錄，退火，得到除多克隆位點外不含其他冗余序列的RNA，避免T7聚合酶在合成目標基因RNA時通讀載體上的序列，影響RNAi結果。除體外轉錄試劑外試劑盒提供載體和對照載體，T7引物，分子量Marker等，還需要自行購買DNase，單鏈特異RNase（核糖核酸酶I）以及dsRNA純化工具。試劑盒2007年價格在3969元人民幣，可合成總量高達2mg的dsRNAs，長度可達1.3kb。
3. Promega公司的T7 RiboMAX Express RNAi System也是一個體外合成dsRNA的試劑盒。特點是合成速度很快，30分鐘完成體外轉錄，適合合成200-400bp或者更長的dsRNA，還可以用于合成21bp的siRNA。產品提供T7 RNA聚合酶，Buffer(含NTP)，消化DNA模板用的DNase和消化單鏈RNA用的RNase，對照模板，最后需要用異丙醇沉淀來純化得到的dsRNA。整個試劑盒足夠合成最高可達2mg的dsRNA，由于沒有配純化的離心柱，可根據需求決定每次使用試劑的量。不帶Marker和引物等對照，價格3195，真不愧是美國“大寶”，價格便宜量又足啊。
4. 如果不怕麻煩，小米加步槍也可以的。通過PCR的方法，或者克隆的方法得到兩端帶有T7啟動子的基因片段模板，自行組裝試劑組合----T7 RNA聚合酶，單鏈RNase，DNase，NTP等等，也不難，要注意防止RNase污染。
