分析蛋白質-DNA 相互作用的甲基化和尿嘧啶干擾分析法實驗

簡介

干擾實驗（甲基化和尿嘧啶）可識別DNA結合位點上的特異殘基。這些殘基經修飾后，可干擾蛋白質與DNA的結合。

來源：《精編分子生物學實驗指南》第五版

操作方法

甲基化干擾分析法

原理

在甲基化干擾實驗中，探針通過將鳥嘌呤N-7及腺嘌呤N-3位用硫酸二甲酯 (DMS)進行甲基化而產生。這些甲基化的堿基可被哌啶特異性切割。

材料與儀器

含有蛋白質結合位點的DNA片段
TE 緩沖液 pH 7.5 ?8.0 硫酸二甲酯（DMS) DMS反應緩沖液 DMS終止緩沖液 10 mg mL tRNA 溶液 0.3 mol L 乙酸鈉 1 mmol L EDTA pH 5. 2 1 mol L哌啶（從10 mol L哌啶儲液稀釋） 終止 加樣染液 儀器與耗材：水浴鍋
水浴鍋

步驟

1) 制備單末端標記的DNA探針。

2) 取約106 cpm的探針溶于5?10μL TE緩沖液中。加入200μL DMS反應緩沖液及 1μl DMS。在禍旋混合器上充分混勻。室溫溫育5 min。

注意：DMS是一種強毒性物質，必須在通風櫥內小心操作。含有DMS的液體應倒在指定的 DMS廢液瓶中，接觸過DMS的吸液頭應放入一個專門的DMS固體廢物瓶中，由安全部門處理。

3) 在探針混合液中加入以下試劑：40μL DMS終止緩沖液、1μL 10 mg/mL tRNA 溶液、600μL 100% 乙醇。混勻后置于干冰/乙醇浴中10 min。微量離心機4℃以最大速度離心10 min。用延長的巴斯德吸管小心吸出上清，置于液體DMS廢液瓶中。

4) 將沉淀重懸于250μL 0. 3 mol/L乙酸鈉、1 mmol/L EDTA中，放置在冰上。加入750μL 100%乙醇，混勻，如步驟3 —樣用乙醇沉淀DNA。

5) 按步驟4重復乙醇沉淀DNA 1次。用70%乙醇洗DNA沉淀1次，離心10 min。小心除去上清，將管子倒扣在吸水紙上，在空氣中晾干10 min。

6) 在閃爍計數儀上測量DNA沉淀的契侖科夫計數，計算其cpm值。用TE緩沖液重 懸至約 20 000 cpm/μL。

7) 用優化的DNA結合條件，如同基本方案步驟9建立一個反應體系，但反應體積放大約5倍（50μL體積中用105 cpm探針）。

8) 將結合反應液加入3個非變性聚丙烯酰胺凝膠樣品孔中。按遷移率變動分析法的條件對其進行電泳。

9) 將凝膠進行放射自顯影，切出相應于蛋白質-DNA結合物及非結合探針的顯影帶，用電洗脫的方法從膠中將DNA純化至DEAE膜上。

10) 用100μL 1 mol/L哌啶重懸沉淀。置于90?95°C水浴中，在管子上加上一玻璃板以防蓋子沖開。小心將管子從水浴中取出，置于干冰上。

11) 在蓋子上用大注射器針頭扎孔，在真空蒸發器（如Speed- vac)中凍干1 h或直至完全凍干。加100μL蒸餾水。再次冷凍和凍干。重復加水，冷凍和凍干。切倫科夫計數并測定樣品的cpm值。

12) 在沉淀中加足夠的終止/加樣染液，濃度以1?2μL體積中含有需加樣的樣品量為宜（3000 cpm足以自顯影過夜）。95°C加熱5 min，迅速置于冰上冷卻。

13) 將非結合探針及蛋白質-DNA結合物加于6%或8%的聚丙驗的烯酰胺/尿素測序膠上。同測序膠一樣進行電泳及放射自干擾的鳥嘌呤和腺嘌呤用顯影。加樣的DNA-蛋白質結合物及非結合探針的計數值相等，以便對不同的樣品進行精確的比較。

尿喀啶干擾分析法

原理

在尿嘧啶干擾實驗中，探針是在TTP和dUTP混合物存在下用PCR擴增而產生，因此產物中的胸腺嘧啶殘基被脫氧尿嘧啶取代（羥基取代了胸腺嘧啶的5- 甲基)。尿嘧啶堿基可被尿嘧啶-N-葡萄糖基化酶特異性切割，產生對哌啶敏感的脫嘧啶位點。

材料與儀器

含有蛋白質結合位點的DNA
針對結合位點兩側的互補DNA鏈上特異序列的寡核苷酸引物 2 mmol L 4種dNTP混合液 0.5 mmol L dUTP Taq聚合酶緩沖液 Taq聚合酶 TE緩沖液 pH 7. 5?8.0 尿嘧啶-N-糖基化酶 1 mol L哌啶（從10 mol L哌啶儲液稀釋） 終止 加樣染液
水浴鍋

步驟

1）用T4噬菌體多核苷酸激酶進行32P標記寡核苷酸引物的5'端設計用來進行PCR擴增的引物，使其包含蛋白質結合位點旁側的序列，并位于兩條互補鏈上。

2) 設立2個平行的含有以下試劑的50μL PCR反應：

5μL含有結合位點的DNA片段（0.2 pmol)

5μL 32P標記的寡核苷酸引物（20 pmol)

5μL另一條寡核苷酸引物（非標記，20 pmol)

5μL 2 mmol/L 4種dNTP 混合液

5μL 0.5 mmol/L dUTP

5μL 10×Taq DNA聚合酶緩沖液

19μL H2O

1μL Taq DNA 聚合酶（5 U)

在優化的PCR擴增條件下做8個循環。

3) 用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化PCR產物，然后進行酚抽提及乙醇沉淀。

4) 在閃爍計數儀上測量DNA沉淀的切倫科夫計數，計算其c/min值。沉淀重懸于TE 緩沖液至約20 000 cpm/μL。

5) 用1O5 cpm的探針在50μL反應體積中進行DNA結合反應，用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結合反應液。

6) 將膠進行放射自顯影（1?12h)，切出對應于蛋白質-DNA復合物和非結合探針的電泳帶，并將其中的DNA純化出來。將各DNA樣品重懸于25μL TE緩沖液中。

7) 建立如下尿嘧啶-N-糖基化酶反應（50μL終體積）：

19μL H2O

5μL 1O× Tag DNA聚合酶緩沖液

25μL DNA (來自步驟6)

1μL尿嘧啶-N-糖基化酶（1 U)，37℃溫育60 min。用乙醇沉淀終止反應。

8) DNA沉淀重懸于100μL 1 mol/L哌啶，90?95℃水浴30 min。在管子上加上一玻璃 板以防蓋子被沖開。哌啶切割之后，將管置于干冰上。

9) 在蓋子上用大注射器針頭扎孔，在真空蒸發器（如Speedvac)中凍干1 h或直至干燥。加100μL蒸餾水，再次冷凍和凍干。重復加水，冷凍和凍干。樣品進行切倫科夫計數。

10) 往沉淀中加入終止/加樣染液。95℃加熱5 min,迅速置于冰上冷卻。將非結合探針及蛋白質-DNA結合物加于6%或8%的測序膠上進行電泳及放射自顯影。