用光密度及數(shù)值分析法決定蛋白質(zhì)結(jié)合的平衡常數(shù)

材料與儀器

含有DNA結(jié)合位點(diǎn)的質(zhì)粒DNA
適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶 100%乙醇及冰冷的70%乙醇 TE緩沖液 [α-32P] dNTP (3000?6000 Ci mmol)水溶液 1O× Klenow片段緩沖液 E. coli DNA聚合酶1的Klenow片段 5 mmol L 4dNTP 混合液 脫氧核糖核酸酶I (DNA酶I; EC3.L4.5) 分析緩沖液A或B 干冰 DNA酶I終止緩沖液 DNA酶I儲(chǔ)存緩沖液 甲酰胺加樣緩沖液
10 mL 一次性塑料管 硅烷化1.5 mL微量離心管 可調(diào)節(jié)水浴鍋（±0. 1℃) 12 in×7.5 in大小的玻璃或不銹鋼碟 有蓋子的塑料微量離心管 6 mm寬間隔12 mm的DNA測(cè)序膠梳 平頭Hamilton注射器（29-G 用于0.4 mm膠）

步驟

1) 用膠片掃描裝置構(gòu)建一個(gè)該膠片的二維數(shù)字圖像。

2) 對(duì)每個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的被保護(hù)DNA區(qū)帶，在每條泳道 上（也就是各配體的每一濃度）的光密度進(jìn)行積分。

最好是將連續(xù)的條帶群作為單獨(dú)一組（即圖中的方塊）來(lái)分析。只要所有被包括在內(nèi)的條帶均勻地出現(xiàn)，這種簡(jiǎn)化是合適的。在所有的泳道上密度最大而且密度較相似的條帶之間的最低密度處（也就是高度保護(hù)區(qū)）畫(huà)出邊界以選定各方塊的兩端。很關(guān)鍵的是，膠片的每泳道中各方塊內(nèi)都含有完全相同的條帶。

3) 為膠片局部背景光吸收而校正各泳道中的各方塊的光密度積分值。可用圖像分析軟件進(jìn)行如下計(jì)算：

a. 在各方塊所在位置上，選定各泳道之間空白處的中心，定義小長(zhǎng)方形

b. 計(jì)算各小長(zhǎng)方形中的像素光密度值的直方圖，將概率最高的像素光密度值定義為局部背景。

c. 對(duì)于每方塊和每泳道，分別算出泳道每側(cè)的平均背景值。

d. 將該平均值乘以方塊中的像素?cái)?shù)目。

e. 從光密度積分值中減去所得值即得到該方塊中的光密度積分校正值。

4) 將各組結(jié)合位點(diǎn)的校正光密度積分值對(duì)該泳道中的總DNA值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

a. 選擇1個(gè)或多個(gè)方塊，除去滴定點(diǎn)及非常高敏感的區(qū)帶，來(lái)代表泳道中的DNA總濃度。

b. 按步驟2及步驟3測(cè)定這些標(biāo)準(zhǔn)塊的光密度積分校正值。

c. 計(jì)算每組結(jié)合位點(diǎn)的光密度比值（Dsite/Dstd)。如果選擇不止一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)組（方塊），則將其和作為Dstd。

選擇兩個(gè)大標(biāo)準(zhǔn)塊較為實(shí)際，也足夠了。其中一個(gè)靠近電泳起始處而遠(yuǎn)離結(jié)合位點(diǎn)， 另一個(gè)則在離起點(diǎn)更遠(yuǎn)處。仔細(xì)檢查每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)塊內(nèi)配體濃度依賴性的系統(tǒng)誤差，這種誤差可導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)無(wú)效。

5)將OD比值按以下公式換算成保護(hù)分?jǐn)?shù)值（f):

f= 1-( Dn, site/Dn,std)/ ( Dr, Site / Dr, std )

式中，n為確定蛋向質(zhì)配體濃度的任一電泳道；r為參考泳道（每個(gè)實(shí)驗(yàn)都必須設(shè)置）， 其中在反應(yīng)混合物中不加蛋白質(zhì)配體。用各組結(jié)合位點(diǎn)的/值對(duì)蛋白質(zhì)配體濃度制作結(jié)合曲線。

如果按所述的方案做，而對(duì)照實(shí)驗(yàn)（Brenowitz et al.，1986a,b)顯示DNA酶I的作用對(duì)蛋白質(zhì)-DNA結(jié)合平衡常數(shù)無(wú)影響，f值就達(dá)到了飽和分?jǐn)?shù)值（F)。能觀測(cè)到的f值往往不能覆蓋全程（0?1)。其原因之一是無(wú)法在加DNA酶I之前計(jì)算DNA的切口 (也就是，即便在飽和配體濃度時(shí)，Dn,siK>0。因此，在分析數(shù)據(jù)時(shí)，最好將f值定義為與結(jié)合曲線成正比的轉(zhuǎn)換曲線，將兩條曲線的極限值U和f分別為上限值和下限值）作為可調(diào)節(jié)參數(shù)。

對(duì)于單結(jié)合位點(diǎn)或相互之間無(wú)協(xié)同作用的多結(jié)合位點(diǎn)，其結(jié)合曲線為L(zhǎng)angmuir等溫線.