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發酵鱖魚中二肽基肽酶-IV抑制肽的形成及抑制機制
發布日期:2024-04-11 10:59:58


發酵鱖魚中二肽基肽酶-IV抑制肽的形成及抑制機制


1 Introduction

糖尿病是一種代謝綜合癥,2021年全世界的患病人數達5.37億人。大多數糖尿病患者屬于2型糖尿病(T2DM),主要是由不同程度的胰島素缺乏和胰島素抵抗所致。血液中胰高血糖素樣肽-1(glucagon -like peptide-1, GLP-1)由小腸分泌,它的活性形式在胰細胞葡萄糖依賴性胰島素的生物合成和分泌中發揮著重要作用,但是活性胰高血糖素樣肽-1會被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)快速降解而失去活性,從而抑制胰島素的分泌,致使血糖升高。食物源的DPP-IV抑制肽具有良好的降血糖效果,可以作為治療高血糖化學合成藥物的潛在替代品。已報道的海洋蛋白質如大口黑鱸、海藻、鮭魚、沙丁魚等是產生各種DPP-Ⅳ抑制肽的良好來源。然而,目前多數發現的DPP-Ⅳ抑制肽通常是通過使用市售蛋白酶水解蛋白質制備的,由于其水解位點的限制,導致產生的DPP-Ⅳ抑制肽的多樣性較低,從而限制了具有高生物活性的新型DPP-Ⅳ抑制肽的發現。

發酵食品是生物活性肽的良好來源。發酵食品中復雜的微生物群落可產生多種多樣的蛋白酶,為發現新型高生物活性DPP-Ⅳ抑制肽提供了可能。然而,目前對發酵食品特別是水產發酵食品中DPP-Ⅳ抑制肽的研究較少。臭鱖魚是一種以鱖魚為原料制作的傳統水產發酵食品。臭鱖魚中的微生物菌群結構復雜,且能夠分泌多種多樣的蛋白酶,因此會產生更多結構多樣的活性肽。而且,鱖魚蛋白中富含脯氨酸,為高活性DPP-IV抑制肽的篩選提供了可能。

近日,中國水產科學研究院南海水產研究所采用宏基因組學、多肽組學及虛擬篩選技術,解析了臭鱖魚發酵過程微生物菌群與DPP-Ⅳ抑制肽的變化規律,借助模擬酶切與相關性網路圖,揭示了微生物代謝導致的臭鱖魚中DPP-Ⅳ抑制肽的形成機制。利用分子對接技術研究了臭鱖魚中DPP-Ⅳ抑制肽與DPP-Ⅳ的能量相互作用,進而闡明了DPP-Ⅳ抑制肽的作用機制。

2 Results and discussion

2.1 臭鱖魚中DPP-IV抑制肽的虛擬篩選

DPP-IV抑制活性實驗表明,臭鱖魚的多肽提取物具有較高的DPP-IV抑制活性,且發酵后活性明顯增加。利用多肽組學技術在臭鱖魚多肽提取物中共鑒定出8 252 種游離多肽,通過活性網站BIOPEP-UWM搜索具有DPP-IV抑制活性的氨基酸殘基片段,不同發酵時間臭鱖魚多肽中共有278 種具有DPP-IV抑制活性的氨基酸殘基,其中KA (2120)、VK (2043)、AE (2025)、KK (1990)、KE (1974)、EK (1957)、EV (1448)、KV (1433)、VE (1424)、PA (1285)、VD (1283)、AD (1270)、KP (1258)、TV (1251)、ET (1221)、AA (1213)、EP (1157)、AP (1111)、AL (1067)和KT (1021)是多肽中出現最多的氨基酸殘基序列。從這些多肽中篩選出疏水性最高(≥22.24 kcal/mol)的前400條肽(P1-P400)作為DPP-IV抑制肽,作者發現大多數DPP-IV抑制肽的豐度在發酵后顯著增加。

2.2 臭鱖魚發酵過程中微生物菌群變化

臭鱖魚中共鑒定出Firmicutes、Proteobacteria、Bacteroidetes、Fusobacteria、Actinobacteria、Uroviricota等6 個細菌門,其中Firmicutes和Proteobacteria為優勢菌門,在整個發酵過程中總相對豐度均超過84%。在不同發酵時間下相對豐度≥0.1%的菌屬共69 個,隨著發酵時間的延長,Escherichia、Bacillus、Kocuria和Pseudomonas的相對豐度顯著降低,而Vagococcus、Psychrobacter、Enterococcus和Peptostreptococcus的相對豐度有所提高。

2.3 臭鱖魚中關鍵微生物屬與DPP-IV抑制肽的相關性網絡

基于Pearson相關性數據構建了35個豐度最高的微生物菌屬與50個豐度最高的DPP-IV抑制肽的相關性網絡。結果顯示,共發現了三個微生物聚類,有21個菌屬與30多個DPP-IV抑制肽顯著相關。Lactococcus、Bacillus、Lysobacter、Pelagivirga、Kocuria和Escherichia與最多的DPP-IV抑制肽相關(48條),其次是Streptococcus和Peptostreptococcus(47條)。其中P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8、P9和P10分別與21、21、6、22、22、18、21、21、22和19個微生物菌屬顯著相關。這幾條DPP-IV抑制肽均為無毒、水溶性好、具有酸性等電點的新型多肽,其中KAGARALTDAETAT(P1)、GEKVDFDDIQK(P2)、VVDADEMYLKGK(P4)和GQKDSYVGDEAQ(P6)穩定且無致敏性,具有潛在的應用價值。

2.4 臭鱖魚中DPP-IV抑制肽的形成和抑制機制

經模擬酶切及相關性網絡分析,DPP-IV抑制肽P1、P2、P4和P6主要由Bacillus、Kocuria、Lysobacter、Lactococcus和Peptostreptococcus產生的枯草桿菌蛋白酶(EC 3.4.21.62)、天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23.1)、嗜熱菌蛋白酶(EC 3.4.24.27)、寡肽酶B (EC 3.4.21.83)和蛋白酶P1(EC 3.4.21.96)酶切形成。分子對接結果顯示,DPP-IV抑制肽P1、P2、P4和P6主要與DPP-IV酶中的Arg、Tyr殘基形成鹽橋,與Arg、Asp、Tyr形成常規氫鍵,與Ser形成碳氫鍵,最終使該酶失活。

3 Conclusion

臭鱖魚多肽中共含有278種具有DPP-IV抑制活性的氨基酸殘基,大多數DPP-IV抑制肽的豐度在發酵后有所提高,與臭鱖魚多肽提取物的活性實驗結果一致。DPP-IV抑制肽KAGARALTDAETAT、GEKVDFDDIQK、VVDADEMYLKGK和GQKDSYVGDEAQ結構中含有眾多活性氨基酸殘基,且本身無毒、水溶性好、穩定、無致敏性,具有潛在的應用價值。這4種DPP-IV抑制肽主要由Bacillus、Kocuria、Lysobacter、Lactococcus和Peptostreptococcus產生的枯草桿菌蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、寡肽酶B和蛋白酶P1酶切形成。DPP-IV抑制肽結構中的活性基團通過與DPP-IV酶中特定的氨基酸殘基形成鹽橋、常規氫鍵和碳氫鍵來發揮抑制作用。本文研究為今后以鱖魚為原料定向制備特定的高活性DPP-Ⅳ抑制肽提供重要的蛋白酶及其微生物來源信息。

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