研究建立適用于多核工業(yè)菌株的基因編輯系統(tǒng)

中國(guó)科學(xué)院微生物研究所高書(shū)山課題組構(gòu)建了一種適用于多核工業(yè)菌的基因編輯系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)大片段DNA無(wú)痕刪除，為我國(guó)微生物工業(yè)發(fā)酵菌株的遺傳改造提供了一種新型高效基因編輯工具，相關(guān)成果以A dual-plasmid CRISPR/Cas system for mycotoxin elimination in polykaryotic industrial fungi為題，發(fā)表在ACS Synthetic Biology上。通過(guò)該方法，高書(shū)山課題組在紅曲紅色素多核生產(chǎn)菌Monascus purpureus中實(shí)現(xiàn)了內(nèi)毒素桔青霉素生物合成基因簇（15 kb）的無(wú)痕敲除。新菌株經(jīng)過(guò)科隆公司的小罐發(fā)酵、中罐發(fā)酵以及大罐發(fā)酵等層層嚴(yán)格驗(yàn)證，發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)顯著高于目前市場(chǎng)上同類產(chǎn)品，已應(yīng)用于千噸級(jí)紅曲紅色素的工業(yè)生產(chǎn)，為企業(yè)取得了經(jīng)濟(jì)效益。

紅曲紅色素是中華民族寶貴的科學(xué)遺產(chǎn)，應(yīng)用于食品業(yè)的著色，也可作為保健品緩解心腦血管和高血脂等相關(guān)疾病。但紅曲紅色素工業(yè)菌株可同時(shí)生產(chǎn)具有腎毒性和致癌性的桔青霉素；我國(guó)和歐盟、日本等均對(duì)產(chǎn)品中桔青霉素的含量做出限制性規(guī)定，我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)為4 mg/kg。由于缺乏較好的遺傳操作工具，目前相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)通過(guò)改變發(fā)酵工藝、隨機(jī)突變等手段，滿足桔青霉素含量標(biāo)準(zhǔn)，造成企業(yè)生產(chǎn)能力的浪費(fèi)；另一方面多數(shù)企業(yè)的紅曲紅產(chǎn)品因桔青霉素含量超標(biāo)而出口受阻，降低了我國(guó)在該領(lǐng)域的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。因此選育低產(chǎn)或不產(chǎn)生桔霉素的新紅曲霉工業(yè)發(fā)酵菌株迫在眉睫。

相較于放線菌等原核生物，多核菌基因組更為龐大和復(fù)雜、在單一細(xì)胞內(nèi)存在不同的細(xì)胞核，普通基因敲除方法難以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的徹底敲除，目前尚未有高效的基因編輯方法應(yīng)用于工業(yè)多核菌株。針對(duì)這一困境，研究人員構(gòu)建了一種新的雙質(zhì)粒基因編輯系統(tǒng)：含密碼子優(yōu)化后的Cas9質(zhì)粒和含有目的基因上下游同源臂的同源重組質(zhì)粒。為了保證敲除效率，在Cas9質(zhì)粒上引入了抗性基因和多核菌自主復(fù)制子。該方法成功實(shí)現(xiàn)桔青霉素生物合成基因簇（>15 kb）高效無(wú)痕刪除。LC-MS檢測(cè)結(jié)果表明，該方法得到的突變株經(jīng)過(guò)10輪培養(yǎng)，仍未檢測(cè)到桔青霉素，且紅曲紅色素產(chǎn)量比改造前提高了約5%。