電穿孔轉化

材料與儀器

待轉化的酵母菌株
1 mol L 二硫蘇糖醇（DTT 過濾除菌并儲存在-20℃) 1 mol L山梨醇 山梨醇選擇平板
電穿孔儀：如Bio-Rad公司的帶脈沖控制器的Gene Pulser或GIBCO BRL公司的 Cell-Porator 0. 2 cm間隙的一次性電穿孔槽（Bio-Rad) 或0.15 cm間隙的微量 電穿孔槽（GIBCO BRL)。

步驟

1) 實驗前2天，將轉化用酵母菌株的單菌落接種于5 mL YPD培養基中，30℃過夜培養至飽和。

2) 轉化前1天晚上，在裝有500 mL YPD培養基的2 L無菌燒瓶中接種適量的過夜培養液，于30℃劇烈搖動培養過夜，直到細胞密度達1×lO8細胞/mL (OD6

這一細胞密度表明細胞處于對數生長的中后期。如果對特定的菌株不知道其精確的生長期，可以用不同體積的飽和培養液接種3個不同的燒瓶（基本方案步驟2)。

3) 于4℃以4000 g離心收獲培養細胞，細胞用80 mL無菌水重懸。為了增加細胞對電 擊的感受性，繼續步驟4。如果這種處理并不需要的話，可接步驟6。

乙酸鋰處理細胞是可選步驟，用這些步驟制備酵母菌會增加操作時間，如果細胞要凍存以備將來使用，那么就不應進行這一過程。

4) 加入10　mL 10×TE緩沖液，pH 7.5。搖勻，再加入100 mL 1０×乙酸鋰儲液，旋轉 搖勻，于30℃輕輕搖動45 min。

5) 加2.5 mL 1 mol/L DTT,并同時旋轉搖動，于30℃輕輕搖動15 min。

6) 將酵母菌懸液用水稀釋至500 mL。

7) 洗滌和濃縮細胞3次，每次以4000?6000 g于4℃離心沉淀細胞，依次重懸細胞， 所用的溶液如下：

第一次沉淀：250 mL冰冷的水第二次沉淀：20?30 mL冰冷的1 mol/L山梨醇 第三次沉淀：0. 5 mL冰冷的l mol/L山梨醇 每次重懸細胞時應劇烈吹打沉淀，使細胞完全分散開。最后重懸酵母菌的體積應在1.0?1.5 mL 之間，最終的OD600應為約200。

使用 Bio-Rad 公司的 Gene Pusler：

8a)往一個無菌、冰冷的1. 5 mL微量離心管加入40μL濃縮的酵母菌細胞和<100 ng轉化DNA (體積<5μL)，混勻。

轉化DNA應溶于低離子強度的緩沖液，如TE或無菌超純水中。不需要長時間溫育，這一時間 可靈活掌握；在轉化過程中不需要載體DNA,加載體DNA會急劇降低轉化效率。使用<10 ng 的質粒DNA轉化時可獲得最大的轉化效率（轉化體/μg)，而使用100 ng DNA轉化時，則可獲得數目最多的轉化體。

9a)將酵母與待轉化DNA混合物轉移到冰冷的0. 2 cm間隙的一次性電穿孔槽中。

1０a)以1.5kV、25μF、200Ω作脈沖轉化，電路中應包括BitRad脈沖控制儀，而這十分重要，如果不這樣做的話，將會損壞Gene Pulser。

Gene PuIser設定的時間常數為4.2?4.9 ms。如果這一時間小于4 ms或出現電流?。纯梢娀鸹ɑ蛎盁煟?，那么說明酵母菌/DNA混合物的電導太高。

1la)往電穿孔槽加入1 mL冰冷的1 mol/L山梨醇，用無菌的9 in巴斯德吸管輕輕混勻、回收酵母細胞。

12a)將一部分酵母菌懸液直接涂布在山梨醇選擇培養基平板上，于30℃培養3?6天， 直到平板上出現菌落。

使用 BRL 的 Cell Porator ：

8b)往一支無菌、冰冷的1.5 mL微量離心管中，加入20μL濃縮的酵母菌和待轉化的 DNA。 DNA 用量<100 ng,體積<5μL。溫育時間可靈活變化（見步驟8a)。

9b)將酵母菌/DNA混合物轉移到冰凍的0.15 cm間隙的電轉槽中。

1０b)以400 V, 10μF，低電阻下進行脈沖轉化。

1lb)取10μL電轉混合物加到1. 5 mL無菌的微量離心管中，其中含有0. 5 mL冰冷的1mol/L山梨醇。

12b)將酵母菌懸液直接涂布在山梨醇選擇培養基平板上，于30℃培養3?6天，直到平板上出現菌落。